患者队列建立与CD19-CAR T细胞治疗
建立接受CD19-CAR T细胞治疗的dcSSc患者队列，并进行纵向皮肤活检采样
11例dcSSc患者接受CD19-CAR T细胞治疗（4例为指定患者用药，7例在CASTLE 1/2期研究NCT06347718中），在基线及治疗后1、6、12个月进行前臂皮肤活检，同时纳入标准治疗对照组和自然病程对照组
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CD19-CAR T细胞治疗系统性硬化症患者皮肤组织重塑的深度表型分析
Deep phenotyping of skin tissue remodeling in patients with systemic sclerosis treated with CD19-CAR T cells
实验完整度
高含患者皮肤活检纵向队列、bulk RNA-Seq、cISH空间转录组、IMC蛋白质组、FAPI PET体内成像，并含功能/机制验证
主要模型
dcSSc患者前臂皮肤活检样本 CD19-CAR T细胞治疗的dcSSc患者队列（CASTLE研究或指定患者用药） 标准治疗对照组及自然病程对照组皮肤活检样本
重点核对
CD19-CAR T细胞静脉输注剂量为1×10⁶ CAR T cells/kg体重，于第0天短时输注 淋巴清除方案：氟达拉滨25 mg/m²静脉注射于第-5、-4、-3天（患者3因肾功能不全和透析减量50%），环磷酰胺1 g/m²静脉注射于第-3天 皮肤活检随访时间点：基线及输注后1个月、6个月、12个月 FAPI PET/CT扫描在输注后3-6个月和12个月、24个月进行，用于评估成纤维细胞激活 外周B细胞在CD19-CAR T细胞应用后9天内完全清除，重建时间在d62至d253之间
摘要
系统性硬化症（SSc）是一种以血管病变及皮肤和内脏器官纤维化重塑为特征的自身免疫性疾病。现有疗法下纤维化组织改变被认为几乎不可逆转，提示需要新的策略来调控疾病相关的分子和细胞表型以实现受累组织的再生。本研究分析了接受CD19-CAR T细胞治疗（作为CASTLE研究或指定患者用药的一部分）的SSc患者的皮肤活检样本，证实SSc皮肤结构发生结构性再生，表现为皮肤乳头的恢复。与这些组织学变化一致，循环原位杂交和成像质谱流式分析提示成纤维细胞群体在组成和功能上向生理状态转变。此外，我们描述了血管修复的迹象及表皮细胞功能的变化。这些结果提示使用CD19-CAR T细胞疗法进行B细胞清除可能促成SSc中的皮肤组织重塑，并突显其在纤维化疾病中促进组织再生的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 深度B细胞靶向治疗（CD19-CAR T细胞）能否调节系统性硬化症的病理组织反应，特别是诱导皮肤组织重塑和真皮乳头再生？
- 核心机制
- CD19-CAR T细胞治疗通过深度清除B细胞，改变成纤维细胞-免疫细胞、成纤维细胞-内皮细胞相互作用，下调促纤维化和促炎信号（如干扰素、TGF-β相关通路），使成纤维细胞群体向生理状态转变，并促进血管生成和表皮重塑，最终导致真皮乳头再生。
- 主要证据
- 通过bulk RNA-Seq、cISH空间转录组和IMC蛋白质组分析显示成纤维细胞群体向生理状态转变（促纤维化FAP+COL8A1+肌成纤维细胞和PU.1+S100A4+成纤维细胞减少，PI16+和TFAM+成纤维细胞增加），FAPI PET显示肺成纤维细胞激活快速降低，组织学显示真皮乳头频率和高度增加、胶原排列减少、血管密度增加和网状嵴增加。
- 研究意义
- 深度B细胞清除可能是首个促进SSc已存在纤维化组织损伤再生的疗法，突显了CD19-CAR T细胞治疗在纤维化疾病中促进组织再生的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
皮肤组织学与临床评估
评估CD19-CAR T细胞治疗对皮肤微解剖结构（真皮乳头、胶原排列、网状嵴）和临床评分（mRSS）的影响
对皮肤切片进行Masson-Trichrome染色，量化真皮乳头数量/高度、胶原排列系数和网状嵴数量；同步记录mRSS评分；使用动态光学相干断层扫描观察皮肤皱褶恢复
皮肤转录组分析（bulk RNA-Seq）
评估CD19-CAR T细胞治疗对皮肤转录组模式的影响
对皮肤活检样本进行bulk RNA-Seq，使用GSEA分析差异富集通路，包括B细胞激活、血管生成、细胞外基质重塑和表皮发育相关基因集
空间转录组分析（cISH/Xenium）
在单细胞水平表征CD19-CAR T细胞治疗后的转录组变化和细胞类型组成
使用Xenium Prime-5k空间转录组 assay 进行循环原位杂交，共回收74,636个细胞，注释主要细胞类型并计算CAR T细胞反应评分，聚焦成纤维细胞亚群和表皮细胞亚群的功能表征
蛋白质组空间分析（IMC）
在蛋白质水平分析CD19-CAR T细胞治疗对成纤维细胞群体组成的影响
使用成像质谱流式技术分析皮肤切片中单细胞分辨率的蛋白质表达，使用包含成纤维细胞、免疫细胞和血管细胞标记物的抗体面板，共收集53,853个细胞，鉴定成纤维细胞亚群并分析其在乳头层和网状层的组成变化
体内成纤维细胞激活成像（FAPI PET/CT）
在体内评估CD19-CAR T细胞治疗对成纤维细胞激活的影响
使用68Ga-FAPI-04或68Ga-FAPI-46 PET/CT评估治疗前后成纤维细胞激活，量化肺部FAPI摄取
血管与表皮变化评估
评估CD19-CAR T细胞治疗对皮肤血管结构和表皮层的影响
通过CD31免疫荧光、毛细血管镜、光学相干断层扫描评估血管变化；通过Masson-Trichrome染色评估网状嵴；通过cISH分析表皮细胞亚群和细胞间通讯
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证分子表达变化
验证免疫效应
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| CD19-CAR T细胞生产 | CliniMACS Prodigy设备 | Miltenyi Biotec | -- |
| 表达抗人CD19 CAR的慢病毒载体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 组织学分析 | Nanozoomer S60v2MD玻片扫描仪 | Hamamatsu Photonics | -- |
| NDPView2软件 | Hamamatsu Photonics | -- | |
| 免疫荧光染色 | 抗CD31抗体 | R&D Systems | AF3628 |
| 抗FAP抗体 | R&D Systems | AF3715 | |
| 抗P4Hβ抗体 | R&D Systems | AF4236 | |
| DAPI | Santa Cruz Biotechnology | sc-3598 | |
| Alexa Fluor二抗 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| RNA提取 | NucleoSpin RNA试剂盒 | Macherey-Nagel | -- |
| Precellys 24组织匀浆器 | -- | -- | |
| RNA测序 | Illumina链特异性mRNA试剂盒 | Illumina | -- |
| NovaSeq-6000测序平台 | Illumina | -- | |
| IMC抗体标记 | Maxpar X8标记试剂盒 | Standard Biotools | 201300 |
| 抗体稳定剂PBS | Boca Scientific | 131050 | |
| IMC染色 | 铱嵌入剂 | Standard Biotools | 201192A |
| IMC成像 | Hyperion成像系统 | Standard Biotools | -- |
| CyTOF Helios | Standard Biotools | -- | |
| 金属涂层调谐玻片 | Standard Biotools | 201088 | |
| IMC细胞分割 | 细胞分割试剂盒 | Standard Biotools | TIS-00001 |
| cISH | Xenium Prime-5k空间转录组检测 | 10X Genomics | -- |
| Xenium细胞分割试剂盒 | 10X Genomics | -- | |
| Xenium分析仪 | 10X Genomics | -- | |
| 光学相干断层扫描 | VivoSight Dx多光束OCT扫描仪 | Michelson Diagnostics Ltd. | -- |
| PET/CT成像 | 68Ga-FAPI-04 | iTheranostics | -- |
| 68Ga-FAPI-46 | iTheranostics | -- | |
| PET/CT扫描仪 | Siemens | -- | |
| 流式分析 | FlowJo软件10.8.1版 | BD | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| CD19-CAR T细胞治疗 | CAR T细胞剂量1×10⁶/kg体重，第0天输注；淋巴清除方案氟达拉滨25 mg/m²第-5至-3天，环磷酰胺1 g/m²第-3天；患者3因肾功能不全减量50% 阅读提示：Methods中CD19-CAR T-cell therapy小节 |
| 皮肤活检采样 | 前臂皮肤活检，时间点为基线及输注后1、6、12个月；各时间点样本量：基线n=18，1个月n=10，6个月n=9，12个月n=10 阅读提示：Results中Signs of regeneration小节及Fig. 1图注 |
| FAPI PET/CT成像 | 68Ga-FAPI-46平均放射性89 MBq（范围47-211 MBq），输注后平均38分钟（范围13-100分钟）采集；扫描时间点：基线n=11，3-6个月n=11，12个月n=7，24个月n=5 阅读提示：Methods中68Ga-FAPI-04/68Ga-FAPI-46 PET-CT examination小节及Fig. 2A图注 |
| cISH空间转录组分析 | Xenium Prime-5k assay，5-µm FFPE切片，探针杂交50°C 17小时；细胞分割使用Xenium Onboard Analysis v3.0和Xenium Ranger v3.1；各时间点细胞数：基线n=7，1个月n=8，6个月n=4，12个月n=4 阅读提示：Methods中Cyclic in-situ hybridization (cISH) and data analysis小节及Fig. 2D图注 |
| IMC蛋白质组分析 | 5-µm FFPE切片，抗体染色过夜4°C；CyTOF Helios耦合Hyperion系统，激光频率200 Hz，像素分辨率1 µm²；PhenoGraph聚类K=40（成纤维细胞）；乳头层/网状层分界距表皮基底膜100 µm；各时间点细胞数：基线13,918，1个月22,807，6个月3,985，12个月13,143 阅读提示：Methods中Imaging Mass Cytometry (IMC)小节及Fig. 3C-H图注 |