建立组蛋白H3先导编辑平台
测试CRISPR先导编辑是否可高效、精准地突变小鼠组蛋白H3基因。
设计靶向12个经典H3基因的epegRNA引入H3K23R及PAM沉默突变，比较PE2、PE3b、PE4和PE5b系统，并通过amplicon NGS评估编辑效率和indel。
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利用高通量CRISPR先导编辑鉴定哺乳动物组蛋白H3中的关键赖氨酸
Identifying critical lysines in mammalian histone H3 with high-throughput CRISPR prime editing
实验完整度
高含小鼠ESC体外模型、H3突变克隆、CUT&Tag/CUT&RUN、RNA-seq、质谱、CRISPR-KO数据及多层级功能验证
主要模型
小鼠胚胎干细胞E14Tg2a TPMB诱导型先导编辑ESC系 H3K23R、H3K14R、H3K18R等组蛋白H3突变ESC克隆 H3K27R+H3K36R双突变ESC
重点核对
PE4/PE5b编辑效率及indel频率比较，n=3独立转染 TPMB ESC中doxycycline诱导prime editor表达 H3K23R克隆全18个H3.1等位基因NGS及24个H3.1/H3.2基因Sanger测序 H3K14R/H3K18R部分编辑克隆中K-to-R与K-to-K对照编辑效率差异 H3K27R+H3K36R双突变体RNA-seq及集落形成能力检测
摘要
组蛋白翻译后修饰是基因组调控的基础，但由于存在多个组蛋白基因拷贝，在哺乳动物中解析单个组蛋白修饰的功能仍然具有挑战性。在这里，我们开发了一种高通量成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）先导编辑平台，能够在其天然基因组背景下对经典和非经典组蛋白H3基因进行精确、可逆和组合诱变。通过系统的赖氨酸到精氨酸替换并以其同义对照为基准，我们鉴定了关键残基，包括H3K4、H3K9、H3K14、H3K18和H3K79，其突变会损害小鼠胚胎干细胞的适合度。我们进一步表明，在酵母和果蝇中与基因组稳定性相关的H3K56在哺乳动物细胞中具有保守作用。通过分析选定的双突变体，我们揭示了残基之间的功能性串扰，其中H3K27R + H3K36R等组合会损害干细胞自我更新并改变转录。总之，本研究建立了哺乳动物组蛋白H3赖氨酸的功能图谱，并提供了一个广泛适用的平台，用于系统解析染色质调控。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何在高拷贝数组蛋白基因背景下，精准、可逆且组合式地突变哺乳动物组蛋白H3赖氨酸，并解析其对胚胎干细胞适合度和染色质调控的功能贡献。
- 核心机制
- 组蛋白H3赖氨酸突变可导致相应组蛋白翻译后修饰丢失；H3K14R、H3K18R、H3K9R、H3K79R和H3K4R等突变造成适合度缺陷，部分位点可通过非经典H3.3补偿或H3K27与H3K36之间的功能串扰影响干细胞自我更新和转录。
- 主要证据
- 在TPMB小鼠ESC中建立PE5b先导编辑平台，获得H3K23R全突变及H3K14R/H3K18R部分突变克隆；通过amplicon NGS、Sanger测序、Western blot、质谱、CUT&Tag/CUT&RUN、RNA-seq和集落形成实验验证编辑、修饰丢失和表型。
- 研究意义
- 建立了哺乳动物组蛋白H3赖氨酸功能图谱，并提供可广泛用于系统解析染色质调控、组蛋白修饰、oncohistone及重复基因组元件功能的平台。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建可诱导TPMB先导编辑细胞系
降低持续错配修复抑制带来的基因组不稳定，同时保持高编辑效率。
生成doxycycline诱导的TetO-PEmax-2A-MLH1dn-2A-BFP（TPMB）ESC，检测BFP表达、PE5b编辑效率和ESC多能性。
获得H3K23R、H3K14R和H3K18R突变克隆
验证不同H3赖氨酸位点能否通过先导编辑生成高编辑或全编辑克隆。
转染epegRNA和nickRNA，doxycycline诱导后分选BFP/eGFP/RFP657阳性细胞，qPCR预筛克隆，再用amplicon NGS、Sanger测序、质谱和Western blot确认编辑与修饰丢失。
验证可逆及组合式组蛋白突变
测试已安装的H3突变能否恢复，并测试多位点组合突变可行性。
设计H3R23K回复epegRNA/nickRNA，在H3K23R ESC中恢复K23；设计同时编码H3K14、H3K18和H3K23的K-to-R或K-to-K突变epegRNA进行组合编辑。
分析H3.3对经典H3K18ac的补偿
检验非经典H3.3是否可补偿经典H3.1/H3.2K18R突变导致的H3K18ac变化。
将H3.3K18R引入WT和部分编辑H3.1/H3.2K18R ESC，获得pan-H3K18R克隆；用Western blot、CUT&Tag和质谱分析H3K18ac分布、H3.3定位及H3.3/H3.1-H3.2比例。
评估先导编辑产生的基因组副产物
检查多靶点组蛋白先导编辑是否诱导组蛋白簇内大尺度基因组改变。
对部分H3K18R和全突变H3K23R克隆进行浅层全基因组测序，并用qPCR测定组蛋白簇1拷贝数，比较含或不含nickRNA条件。
系统筛选H3赖氨酸对ESC适合度的贡献
系统评估经典H3中13个赖氨酸残基突变对细胞适合度的影响。
对每个赖氨酸设计K-to-R和K-to-K epegRNA，转染TPMB ESC，11天编辑后分析细胞池并进行单细胞分选克隆；qPCR预筛47个克隆后对12个高编辑克隆进行amplicon NGS。
验证组蛋白修饰丢失及功能效应
确认高编辑克隆中目标组蛋白修饰丢失，并评估相关功能表型。
对H3K27R、H3K36R、H3K37R、H3K9R、H3K79R、H3K23R和H3K56R等克隆进行Western blot、CUT&Tag/CUT&RUN、质谱、药物处理和生长/集落形成实验。
解析双突变体的功能串扰
研究H3K23、H3K27、H3K36和H3K37之间的功能互作。
以高编辑单突变体为起始群体，顺序引入双突变组合，获得双突变克隆；对H3K27R+H3K36R进行RNA-seq、集落形成和修饰Western blot分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证编辑效率与克隆特征
验证分子表达与修饰变化
分析转录组与遗传互作
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | Glasgow最低必需培养基 | Sigma-Aldrich | G5154 |
| L-谷氨酰胺 | Gibco | 25030-081 | |
| MEM非必需氨基酸 | Gibco | 11140-035 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 21985023 | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | L3000008 |
| 减血清培养基 | Gibco | 31985062 | |
| 克隆筛选 | 多西环素 | -- | -- |
| 慢病毒转导 | 聚凝胺 | -- | 10 µg ml−1 |
| 扩增子NGS | Phusion高保真PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | F531 |
| Mag-Bind TotalPure NGS磁珠 | Omega Bio-Tek | M1378 | |
| Qubit 1× dsDNA高灵敏度检测试剂盒 | Invitrogen | Q33231 | |
| 高灵敏度D1000 ScreenTape | Agilent Technologies | 5067-5584 | |
| qPCR | PowerUp SYBR green预混液 | Thermo Fisher Scientific | 100029284 |
| 拷贝数qPCR | 靶向Trim38的TaqMan探针 | Thermo Fisher Scientific | Mm00608206_cn |
| TaqMan拷贝数参照检测Tfrc | Thermo Fisher Scientific | 4458366 | |
| TaqMan基因分型预混液 | Thermo Fisher Scientific | 4371353 | |
| Western blot | Benzonase核酸酶 | Merck Millipore | 70746 |
| Pierce BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23227 | |
| Bolt Bis–Tris 4–12%梯度胶 | Invitrogen | NW0412 | |
| Bolt MES-SDS运行缓冲液 | Invitrogen | B0002 | |
| 硝酸纤维素膜 | Invitrogen | IB23001 | |
| PVDF膜 | Invitrogen | IB24001 | |
| 浅层全基因组测序 | Monarch基因组DNA纯化试剂盒 | NEB | T3010 |
| Covaris E220超声破碎仪 | Covaris | 500239 | |
| NEBNext Ultra II DNA文库构建试剂盒 | NEB | E7645 | |
| 类原肠胚形成 | DMEM-F12培养基 | Gibco | 11320074 |
| GlutaMAX添加剂 | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Neurobasal培养基 | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| B27添加剂 | Gibco | 175040044 | |
| β-巯基乙醇 | Gibco | 31350010 | |
| 96孔U底板 | Greiner Cellstar | 650185 | |
| 集落形成 | 白细胞碱性磷酸酶试剂盒 | Sigma-Aldrich | 86R |
| RNA提取与qPCR | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | 74016 |
| Transcriptor Universal cDNA Master | Roche | 5893151001 | |
| CUT&RUN | ConA顺磁珠 | EpiCypher | 21-1401 |
| CUT&Tag | CUTANA非热启动PCR预混液 | EpiCypher | 15-1018 |
| RNA-seq | poly(A) mRNA磁分离模块 | New England Biolabs | E7490 |
| Ultra II定向RNA文库构建试剂盒 | New England Biolabs | E7760 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 先导编辑系统建立 | 细胞模型为表达PEmax的ESC；比较PE2、PE3b、PE4、PE5b；目标为H3K23R及PAM沉默突变；检测18个H3.1等位基因；n=3独立转染。 阅读提示：查阅Methods中Plasmids and cloning、Cell culture、Amplicon-based NGS，以及Fig. 1a–c图注。 |
| TPMB诱导型细胞系培养与编辑 | TPMB ESC由pPB-rtTA-zeo、pPB-TetO-2A-MLH1dn-2A-BFP-hygro和PBase转座酶共转染生成；编辑期间doxycycline 1 µg ml−1；转染后24 h puromycin选择。 阅读提示：查阅Methods中Cell culture及Fig. 1d–f图注。 |
| H3K23R、H3K14R、H3K18R克隆生成 | 转染epegRNA和nickRNA；分选BFP、eGFP、RFP657阳性细胞；每位点预筛47个克隆；H3K14R和H3K18R可进行2–3轮epegRNA/nickRNA转染。 阅读提示：查阅Methods中Flow cytometry、qPCR for assessing editing efficiency，以及Fig. 1g–j、Fig. 2c–f和Extended Data Fig. 3a–c图注。 |
| H3赖氨酸适合度筛选 | TPMB ESC转染K-to-R或K-to-K epegRNA，n=3独立转染；编辑11天；qPCR预筛47个克隆；取12个最高编辑克隆做amplicon NGS；H3K4需5个epegRNA，H3K9需2个。 阅读提示：查阅Methods中Cell culture、Amplicon-based NGS and data analysis，以及Fig. 6b图注和Extended Data Fig. 5f,g。 |
| H3K18ac补偿及H3.3定位分析 | 比较H3.1/H3.2K18K、H3.1/H3.2K18R和H3.1/H3.2/H3.3K18R；CUT&Tag用E. coli spike-in归一化；CUT&RUN用Drosophila spike-in归一化；RNA-seq n=3生物学重复。 阅读提示：查阅Methods中Automated C&R、Automated C&T、C&T and C&R analysis，以及Fig. 4h–l图注。 |
| 基因组副产物评估 | 浅层全基因组测序目标片段200 bp；拷贝数qPCR使用Trim38探针和Tfrc参照；分组为含nickRNA与不含nickRNA；每组>20个独立克隆。 阅读提示：查阅Methods中Shallow whole-genome sequencing and data analysis、qPCR for assessing histone cluster 1 copy number，以及Fig. 5c–f图注。 |