胚胎收集与玻璃化
获取并冷冻保存小鼠和人卵裂期胚胎。
小鼠胚胎通过超排卵后交配收集，人胚胎来自临床捐赠。胚胎经玻璃化冷冻保存。
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多组学与发育比较：直接复温与传统复温方法在玻璃化人及小鼠卵裂期胚胎中的应用
Multi-omics and developmental comparison of direct and conventional warming methods in vitrified human and mouse cleavage-stage embryos
实验完整度
高包含小鼠体外发育、胚胎移植、出生后发育评估，以及人和小鼠转录组与DNA甲基化多组学分析，实现体内外功能与分子验证。
主要模型
小鼠卵裂期胚胎（C57BL/6J） 人捐献卵裂期胚胎
重点核对
胚胎发育时期（6-10细胞或桑葚胚） 卵裂球存活率是否≥50% RNA-seq和WGBS测序中DEGs和DMRs的筛选阈值（|log2FC|>1, 调整后P<0.05；甲基化差异≥20%, q<0.01） 胚胎移植中每只受体移植5-12个囊胚
摘要
研究问题：直接复温是否与传统的多步复温一样，能够保持玻璃化人及小鼠卵裂期胚胎的发育能力和分子完整性？
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 直接复温是否能替代传统多步复温，安全有效地用于玻璃化人及小鼠卵裂期胚胎？
- 核心机制
- 高渗透性冷冻保护剂在复温时快速外流，同时等渗培养液调节水分内流，减少了渗透压休克和毒性，从而保持胚胎发育能力。
- 主要证据
- 小鼠胚胎在直接复温组与传统组在存活率、囊胚形成率、着床率及活产率均无显著差异；人及小鼠转录组和甲基化组分析显示DEGs和DMRs无显著通路富集，关键发育基因表达稳定。
- 研究意义
- 直接复温简化了操作流程，可作为传统多步复温的替代方案，尤其适用于资源有限的环境，但需进一步的临床研究确认长期安全性。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
直接复温与传统复温处理
比较两种复温方法对胚胎存活率的影响。
小鼠胚胎随机分配至直接复温（直接放入M2培养基）或传统复温（0.25M蔗糖）；人胚胎直接放入G-TL培养基或传统步骤。
体外发育评估
评估复温后胚胎的存活和发育能力。
胚胎在培养箱中培养，用EmbryoScope或Primo Vision连续监测发育至囊胚阶段，并评估存活率、囊胚形成率和优质囊胚率。
胚胎移植与妊娠评估
评估复温后的胚胎在体内的着床和发育潜力。
小鼠囊胚移植至假孕雌鼠（TCET），评估着床率、活产率及出生后到第21天的生长发育。
转录组和甲基化组测序
比较分子层面（转录组和DNA甲基化）差异。
对复温后的胚胎进行RNA-seq（转录组）和WGBS（甲基化），分析差异表达基因和差异甲基化区域。
生物信息学与统计分析
处理测序数据并进行差异表达、差异甲基化及通路分析。
使用HISAT2比对RNA-seq，featureCounts定量，DESeq2分析差异；Bismark处理WGBS数据，甲基化水平由methylKit分析；功能富集用clusterProfiler。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胚胎玻璃化 | Irvine Scientific玻璃化试剂盒 | Irvine Scientific | 90183 |
| 胚胎培养 | G-TL培养基 | Vitrolife | 10145 |
| KSOM培养基 | Sigma-Aldrich | MR-106 | |
| 矿物油 | Vitrolife | 10029 | |
| M2培养基 | Sigma-Aldrich | MR-015 | |
| 胚胎玻璃化 | DAP213溶液 | COSMO BIO USA | KYD-013-EX-0.5 |
| 胚胎复温 | 蔗糖溶液 | COSMO BIO USA | KYD-014-EX-2 |
| 胚胎培养 | EmbryoScope延时培养箱 | Vitrolife | -- |
| Primo Vision延时系统 | Vitrolife | -- | |
| 胚胎移植 | 经宫颈胚胎导管移植 | Baoding Zhengmu Biotechnology | -- |
| 超排卵 | 孕马血清促性腺激素 | BioVendor | RP1782725000 |
| 人绒毛膜促性腺激素 | Sigma-Aldrich | C1063 | |
| RNA-seq | SMART-Seq全RNA Pico输入试剂盒 | Takara Bio | 634355 |
| 甲基化测序 | Pico甲基化测序文库制备试剂盒 | Zymo Research | D5456 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 胚胎收集与玻璃化 | 胚胎发育时期（6-10细胞或桑葚胚），玻璃化方法 阅读提示：Materials and methods - Mouse embryo experiments |
| 复温与体外培养 | 直接复温组使用预平衡（37°C）培养基，传统组使用蔗糖梯度；培养基型号（G-TL、KSOM、M2） 阅读提示：Materials and methods - Vitrification and warming procedures |
| 移植后评估 | 移植数量和胎龄（5-12个囊胚，7.5dpc；出生后PND1-21评估） 阅读提示：Materials and methods - Evaluation and transfer |