TNFR1敲除肿瘤细胞系的建立及验证
确定肿瘤细胞中TNFR1缺失对肿瘤体内生长的作用。
使用CRISPR/Cas9技术敲除多种小鼠肿瘤细胞系（MC38、EO771、CT26、B16OVA等）和人HT29细胞系中的TNFR1，并通过流式、测序和RT-qPCR验证。
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癌细胞上的TNFR1表达介导免疫逃逸和免疫抑制微环境
TNFR1 expression on cancer cells mediates immune escape and an immunosuppressive microenvironment
实验完整度
高包含体外细胞系基因编辑、体内移植瘤及遗传性HCC模型、功能验证（CD8依赖）、机制验证（MDSC浸润及RNA-seq）以及人类样本数据分析。
主要模型
MC38结肠癌细胞系及其TNFR1敲除变体 EO771乳腺癌细胞系及其TNFR1敲除变体 HT29人结肠癌细胞系及其TNFR1敲除变体 遗传性多灶性肝细胞癌（HCC）小鼠模型
重点核对
细胞系及TNFR1敲除状态：MC38、EO771、CT26、B16OVA等及单克隆或多克隆TNFR1KO变体 小鼠品系：C57BL/6、Rag1−/−、BATF3−/−、Rag2−/−IL-2Rγ−/−、NSG 接种细胞数和方式：皮下接种0.5×10^6或2×10^6细胞，50 μl PBS CD8β和CD4耗竭抗体剂量及给药方案：腹腔注射100 µg，接种前一天开始，每周两次 TNFα处理浓度及时间：1000 U/ml，培养上清72小时收集
摘要
TNFα是一种促炎细胞因子，可在癌症中介导免疫抑制作用。我们通过CRISPR/Cas9沉默了TNFR1的肿瘤显示，TNFR1KO变体在免疫功能正常宿主中植入不良，而在免疫缺陷或CD8 T淋巴细胞耗竭的小鼠中植入得以保留。该机制由TNFα在恶性肿瘤细胞本身引发的次级趋化性炎症介质介导。因此，TNFR1KO变体在肿瘤微环境中招募的髓源性抑制细胞（MDSCs）显著减少，从而解释了WT变体的免疫逃逸。有趣的是，少量TNFR1充足的肿瘤细胞与TNFR1KO变体共植入，在同一肿瘤病灶中挽救了致瘤性，但在远处植入的TNFR1KO肿瘤中则不能。次级介质主要包括作用于CXCR1/2的趋化因子、前列腺素E2和TNFα本身。在人类肿瘤细胞系中敲低TNFR1，在异种移植时产生了相当的MDSC招募结果。对人类实体瘤的scRNA-seq和空间转录组学数据集的分析，证实了肿瘤细胞上TNFR1在诱导次级促肿瘤炎症介质中的作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 癌细胞自身表达的TNFR1是否以及在何种机制上介导肿瘤免疫逃逸和免疫抑制微环境形成？
- 核心机制
- 癌细胞上的TNFR1响应TNFα后诱导多种次级促炎介质（包括CXCR1/2趋化因子、PGE2和TNFα本身），这些介质招募MDSC进入肿瘤微环境，从而抑制CD8 T细胞介导的抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- TNFR1KO肿瘤变体在免疫活性小鼠中生长受抑或排斥，而在免疫缺陷或CD8耗竭小鼠中恢复生长；共植入实验证明局部TNFR1阳性细胞可拯救TNFR1KO肿瘤；体外和体内实验显示TNFR1介导的细胞因子/趋化因子分泌和MDSC招募；人类肿瘤单细胞和空间转录组数据支持TNFR1表达与炎症因子及MDSC的相关性。
- 研究意义
- 该研究强调了肿瘤细胞内在的TNFα/TNFR1信号在塑造免疫抑制微环境中的关键作用，提示在联合免疫治疗中靶向TNFα/TNFR1轴具有治疗意义。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
TNFR1敲除变体的体内致瘤性评估
评估TNFR1缺失是否影响肿瘤在免疫活性小鼠中的生长。
将WT和TNFR1KO细胞皮下接种于同系免疫活性小鼠（C57BL/6或BALB/c）或免疫缺陷小鼠（Rag1−/−、NSG等），监测肿瘤生长及排斥率。
免疫细胞耗竭实验
鉴定介导TNFR1KO肿瘤排斥的免疫细胞类型。
使用抗CD4或抗CD8β单克隆抗体耗竭小鼠，观察对TNFR1KO肿瘤生长的影响。
共植入和双侧植入实验
评估TNFR1表达肿瘤细胞是否通过旁分泌方式拯救TNFR1KO变体致瘤性。
将WT和TNFR1KO细胞以不同比例（1:1或1:5）混合皮下接种；或将WT和KO细胞植入同一小鼠对侧皮下，监测肿瘤生长。
患者来源/基因工程小鼠模型验证
在自发性肿瘤模型中验证TNFR1缺失的抗肿瘤效果。
使用水动力尾静脉注射质粒诱导小鼠多灶性HCC，同时敲除p53和TNFR1，通过生物发光成像监测肿瘤发生。
体外细胞因子/趋化因子诱导检测
研究TNFα对肿瘤细胞次级炎症介质表达的诱导。
用重组TNFα刺激WT和TNFR1KO细胞，收集上清液检测CXCL1、CXCL2、CCL2、CSF-1、PGE2等浓度。
肿瘤微环境MDSC分析
验证TNFR1信号是否影响MDSC招募。
将WT和TNFR1KO肿瘤植入小鼠，瘤内注射TNFα或不注射，通过流式细胞术检测肿瘤内Gr-MDSC和M-MDSC密度。
转录组测序分析
揭示TNFR1介导的下游信号通路和炎症介质。
对TNFα刺激的EO771和HT29细胞进行RNA-seq，以及从肿瘤中分选的CD11b+细胞RNA-seq，分析差异表达基因和通路富集。
人类肿瘤公共数据集生物信息学分析
验证人类肿瘤中TNFR1表达与炎症介质和MDSC招募的关联。
利用公共scRNA-seq和空间转录组数据，比较TNFR1高/低癌细胞亚群的炎症因子表达，并分析TNFR1高肿瘤生态位中MDSC丰度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与基因编辑 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco | -- | |
| 遗传霉素 | Gibco | -- | |
| MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | -- | |
| CRISPR/Cas9表达质粒 | GenScript | -- | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗CD120a抗体 | BioLegend | 113003 | |
| NucleoSpin | -- | 740609 | |
| TNF-R1 CRISPR/Cas9敲除质粒 | Santa Cruz | sc-400206-KO-2 | |
| 重组TNFα | PeproTech | 300-01A | |
| IL8 ELISA试剂盒 | BD | 555244 | |
| 细胞转染 | pLV[Exp]-Puro-EF1A>mTnfrsf1a慢病毒载体 | Vector Builder | -- |
| 细胞培养 | 聚凝胺 | -- | -- |
| 嘌呤霉素 | -- | -- | |
| 增殖检测 | IncuCyte SX5活细胞分析系统 | -- | RRID:SCR_026298 |
| 动物实验 | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 抗CD8β抗体 | BioXcell | BE0223 | |
| 抗CD4抗体 | BioXcell | BE0003 | |
| 大鼠IgG同型对照抗体 | BioXcell | BE0094 | |
| HCC质粒（pT4-EGFP，pT3-c-myc-luc，pCMV-SB13，pgRNAp53-Cas9，TNFR1-CRISPR/Cas9） | Addgene | 108352, 129775 | |
| IVIS Spectrum活体成像系统 | Perkin Elmer | -- | |
| 流式分析 | 胶原酶/DNase I | -- | -- |
| 70μm细胞筛网 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 抗CD16/32 Fc受体阻断剂 | BioLegend | 101320 | |
| 抗CD45.2-FITC抗体 | BioLegend | 109806 | |
| 抗CD4-BUV496抗体 | BD Bioscience | 612952 | |
| 抗CD8-AF700抗体 | BioLegend | 100730 | |
| 抗CD11b-BUV395抗体 | BD Bioscience | 563553 | |
| 抗Ly6C-AF467抗体 | BioLegend | 128010 | |
| 抗Ly6G-BV510抗体 | BioLegend | 127633 | |
| 抗F4/80-PECy7抗体 | BioLegend | 123114 | |
| 抗CD3-PerCPeF710抗体 | eBioscience | 46-0032-82 | |
| 抗CD11b-BV650抗体 | BioLegend | 101259 | |
| 抗F4/80-BV421抗体 | BioLegend | 123132 | |
| 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 | |
| gentleMACS Octo组织解离器 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 抗TNFα-BV421抗体 | BioLegend | 506327 | |
| 大鼠IgG1同型对照 | BioLegend | 401921 | |
| GolgiStop蛋白转运抑制剂 | BD Biosciences | 554724 | |
| 抗CD45-BUV496抗体 | BD Horizon | 569670 | |
| 抗CD11b-FITC抗体 | BioLegend | 101206 | |
| 抗TNFR1-PE抗体 | BioLegend | 113003 | |
| 抗CD31-BV421抗体 | BD Horizon | 562939 | |
| 抗CD90.2-BV605抗体 | BioLegend | 105343 | |
| 亚美尼亚仓鼠IgG | BioLegend | 400908 | |
| Zombie NIR固定活力试剂盒 | BioLegend | 423106 | |
| 7AAD活力试剂盒 | BioLegend | 420404 | |
| CytoFLEX流式细胞仪 | Beckman Coulter | -- | |
| 免疫组化 | Bond RX自动染色仪 | Leica Biosystems | -- |
| Bond脱蜡液 | Leica Biosystems | -- | |
| Bond抗原修复液2 | Leica Biosystems | AR9640 | |
| 抗CD11b抗体 | Novus Biologicals | NB110-89474 | |
| 抗F4/80抗体 | Abcam | ab300421 | |
| Spectral DAPI | Akoya Biosciences | FP1490 | |
| ProLong Diamond防淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PhenoImager HT自动定量病理成像系统 | Akoya Biosciences | -- | |
| inForm软件 | Akoya Biosciences | -- | |
| 分子生物学 | Maxwell RSC RNA提取试剂盒 | Promega | AS1340 |
| M-MLV逆转录酶试剂盒 | Invitrogen | 28025013 | |
| Bio-Rad CFX实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | CXCL1 ELISA试剂盒 | R&D Systems | SMKC00B |
| CXCL2 ELISA试剂盒 | R&D Systems | MM200 | |
| CCL2/JE/MCP-1 ELISA试剂盒 | R&D Systems | MJE00B | |
| M-CSF ELISA试剂盒 | R&D Systems | MMC00B | |
| 前列腺素E2 ELISA试剂盒 | Abcam | ab287802 | |
| MPGES-1 ELISA试剂盒 | Antibodies | A75765 | |
| RNA-seq | RNeasy迷你RNA提取试剂盒 | Qiagen | 74104 |
| Macrogen测序服务 | Macrogen | -- | |
| 流式分选 | 抗CD11b-PE抗体 | BioLegend | 101208 |
| MoFlo Astrios EQ分选仪 | Beckman Coulter | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系与基因编辑 | 细胞系来源、TNFR1敲除策略（CRISPR/Cas9，gRNA序列）、单克隆/多克隆混合、验证方法（流式，Sanger测序，RT-qPCR） 阅读提示：Materials and methods: Cell lines and CRISPR/Cas9 engineering |
| 体内肿瘤模型 | 小鼠品系（C57BL/6、BALB/c、Rag1-/-、BATF3-/-、NSG等），细胞接种数量及方式（皮下、50μl PBS），肿瘤测量频率，观察终点 阅读提示：Materials and methods: Mouse strains and in vivo experiments; Figure legends 1, 2 |
| 免疫细胞耗竭 | 耗竭抗体克隆（抗CD8β、抗CD4），剂量（100μg），给药时间（接种前一天开始，每周两次） 阅读提示：Materials and methods: Mouse strains and in vivo experiments; Figure 2 |
| TNFα处理 | TNFα来源（PeproTech），浓度（1000 U/ml），刺激时间（体外72h，体内瘤内注射剂量50ng和次数） 阅读提示：Materials and methods: Quantitative RT-PCRs and ELISAs; Figure 4 |
| MDSC分析 | 肿瘤消化方案（酶解时间，细胞筛），流式抗体panel，流式仪器，样本量（n=6-14），统计方法 阅读提示：Materials and methods: Flow cytometry on tumor-derived cell suspensions; Figure 4 |
| RNA-seq分析 | 细胞培养和处理时间，RNA提取试剂盒，测序平台（Macrogen），数据分析流程（比对，定量，差异分析），参考基因组版本 阅读提示：Materials and methods: Tumor cell lines bulk RNA-seq sequencing and analysis; CD11b+ myeloid cell sorting and bulk RNA-seq |
| 人类肿瘤数据分析 | 数据来源（GEO ID），细胞类型注释方法，TNFR1高低的阈值定义，空间转录组处理（Cell2location参数），统计检验 阅读提示：Materials and methods: Biometric analyses of spatial transcriptomics; scRNA-seq data analysis |