A Patient-Derived Xenograft Repository Capturing Clinical and Molecular Heterogeneity of Large B-cell Lymphoma
研究包括PDX模型生成与验证（IHC/FISH/EBV）、多组学分析（WES、RNA-seq、ATAC-seq）、体外功能实验及CART19体内疗效评估等多层级证据。
NSG小鼠肾包膜移植的大B细胞淋巴瘤PDX模型 CART19耐药PDX模型（来自治疗后进展活检） T细胞受体敲除的CART19细胞
PDX模型生成采用肾包膜植入NSG小鼠，活检组织需在30天内复苏，成功率与新鲜植入相当。 分子特征分析（WES、RNA-seq、ATAC-seq）需与患者原始肿瘤匹配验证（本文对9例验证）。 体内CART19实验采用7个PDX模型，每模型12只小鼠，尾静脉注射2x10^6个CAR阳性TCR-KO CART19细胞。 PDX模型亚型分布存在偏差，如TP53、CREBBP等突变频率偏高，需注意与rrLBCL人群比较。
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从LBCL患者活检组织生成涵盖不同组织学亚型的PDX模型，并评估植入效率和模型保真度。
将133例LBCL活检组织（包括98例DLBCL、19例HGBCL等）通过肾包膜植入NSG小鼠，观察肿瘤生长，成功生成48个新PDX模型（来自45名患者）。部分活检新鲜植入，部分冻存后植入，比较了不同处理方式的成功率。对F2代肿瘤进行H&E、IHC（CD20、BCL2、CD10、MUM1、MYC、BCL6、CD19）和FISH（MYC、BCL2、BCL6）检测，与患者同步活检结果比较。
通过多组学方法系统表征PDX模型并评估其对原发肿瘤的保真度，以及覆盖LBCL分子亚型的程度。
对80个PDX模型（包括48个新模型和外部来源模型）进行了WES、lpWGS、RNA-seq和ATAC-seq分析，并使用DLBCL90转录亚型测定和LymphGen遗传亚型分类，与外部rrLBCL队列（n=80）比较突变频谱和亚型分布。分析了突变VAF与配对肿瘤样本的相关性（n=9）。
检验来自CART19治疗后进展的PDX模型是否保留肿瘤细胞内在耐药性，对CART19处理有无反应。
从3个健康供体生成TCR-KO的CART19细胞，在体外验证其杀伤活性。选取7个PDX模型（1个CART19初治，6个CART19后进展），每只小鼠尾静脉注射2x10^6 CAR阳性细胞，每组4只小鼠，共12只/模型。处理后部分小鼠在14天时安乐死，收集肿瘤进行T细胞浸润分析（流式、IHC），其余小鼠每周MRI监测至4周或濒死。评估肿瘤体积变化和清除情况。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 组织处理 | AllPrep DNA/RNA提取试剂盒 | Qiagen | 80204 |
| DNA定量 | Qubit高灵敏度双链DNA定量试剂盒 | Life Technologies | Q32854 |
| 文库制备 | KAPA HyperPlus文库构建试剂盒 | Roche | KK8512 |
| 文库纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | A63881 |
| RNA提取 | AllPrep DNA/RNA提取试剂盒 | Qiagen | 80204 |
| RNA定量 | Qubit高灵敏度RNA定量试剂盒 | Life Technologies | Q32852 |
| RNA文库构建 | KAPA HyperPrep RNA文库构建试剂盒（含RiboErase） | Roche | KK8560 |
| ATAC-seq DNA纯化 | Zymo DNA清洁和浓缩-5试剂盒 | Zymo | D4024 |
| ATAC-seq文库构建 | KAPA HyperPrep文库构建试剂盒 | Roche | KK8502 |
| T细胞培养基 | CTS OpTmizer T细胞扩增无血清培养基 | Gibco | -- |
| T细胞刺激 | ImmunoCult人CD3/CD28/CD2 T细胞激活剂 | STEMCELL Technologies | -- |
| 重组人IL-2 | GenScript | -- | |
| 电穿孔 | Buffer T | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Cas9蛋白 | Synthego | -- | |
| 靶向TRAC的sgRNA | Synthego | -- | |
| Neon转染系统 | Invitrogen | -- | |
| 病毒转导 | OptiMEM培养基 | Gibco / Thermo Fisher Scientific | 31985070 |
| Vectofusin-1转导试剂 | Miltenyi Biotec | -- | |
| T细胞分选 | 抗人TCRα/β抗体 | BioLegend | -- |
| MACS磁珠分选系统 | Miltenyi Biotec | -- | |
| T细胞扩增 | G-Rex 6M培养板 | Wilson Wolf | -- |
| 流式分析 | VioBright B515抗CD19 CAR FMC63独特型抗体 | Miltenyi Biotec | -- |
| Alexa Fluor 647标记抗TCRα/β抗体 | BioLegend | -- | |
| ViaDye Red活细胞染料 | Cytek | -- | |
| 细胞毒性检测 | Incucyte SX5活细胞成像系统 | Sartorius | -- |
| 病毒生产 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Thermo Fisher Scientific | 11668019 | |
| psPAX2包装质粒 | Addgene | 12260 | |
| pMD2.G包膜质粒 | Addgene | 12259 | |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 病毒转导 | 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G |
| IHC | BOND RX自动染色仪 | Leica Biosciences | -- |
| BOND聚合物精制检测试剂盒 | Leica Biosciences | DS9800 | |
| Cytoseal XYL封片剂 | Electron Microscopy Sciences | 18009 | |
| ISH | Ventana肽核酸原位杂交检测试剂盒 | Roche | 08318883001 |
| FISH | MYC分离探针 | Abbott | 05J9101 |
| BCL6分离探针 | Abbott | 01N2320 | |
| BCL2分离探针 | Abbott | 07J7501 | |
| IGH/BCL2双融合探针 | Abbott | 05J7101 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| PDX模型生成（肾包膜植入） | 植入部位（肾包膜），小鼠品系（NSG），活检处理方式（新鲜或冻存<30天），植入前是否需同步病理报告确认LBCL，监测时间（6个月），成功标准（肿瘤可触及或MRI可检测）。 阅读提示：Methods：Renal Capsule Implantation； Results：Generation of PDX Models； Figure 1A-D |
| 分子表征（WES/lpWGS/RNA-seq/ATAC-seq） | 样本类型（F2肿瘤），配对正常对照（25/48有），测序平台（Illumina NovaSeq 6000），WES覆盖深度（肿瘤50X、对照30X），lpWGS深度（1X），RNA-seq分析流程（过滤至少20M reads），ATAC-seq细胞数（50,000活细胞）。 阅读提示：Methods：WES、lpWGS、RNA-seq、ATAC-seq； Results：Molecular Landscape； Figure 2,3 |
| CART19耐药模型验证（体内） | CART19细胞制备（TCR敲除、病毒转导、纯度），处理剂量（2x10^6 CAR阳性细胞），给药途径（尾静脉），实验模型数（7个PDX），每模型小鼠数（12只），监测时间（14天安乐死部分，其余4周MRI），肿瘤浸润评估方法（流式、IHC）。 阅读提示：Methods：In Vivo Assessment of CART19 Response； Results：Tumor Cell-Intrinsic Resistance； Figure 5 |
