小鼠品系构建与验证
生成并鉴定HTR2A报告小鼠，确认EGFP和Cre的准确表达及受体功能的保留。
利用CRISPR-Cas9在Htr2a基因座插入EGFP和IRES-Cre/CreERT2，并通过RNAscope、免疫组化、Western blot和放射性配体结合实验验证其表达和功能。
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一套用于探究迷幻药作用机制的小鼠工程套件
A suite of engineered mice for interrogating psychedelic drug actions
实验完整度
高包含多个独立证据层级：转基因小鼠构建、全脑定位、配体结合、Western blot、RNAscope、电生理和行为学分析。
主要模型
Htr2aEGFP-CreERT2小鼠 Htr2aCre小鼠 Htr2aA242S-EGFP-Cre小鼠 C57BL/6J小鼠
重点核对
Htr2aEGFP-CreERT2小鼠中EGFP插入HTR2A C末端不影响受体功能，LSD诱导的受体下调正常。 DOI（1 mg/kg，i.p.）在旷场实验中诱导Htr2aEGFP-CreERT2小鼠高运动活性，且在C57小鼠中同样有效。 LSD（0.3 mg/kg，i.p.）、DOI（1 mg/kg）和psilocin（1 mg/kg）在C57和Htr2aEGFP-CreERT2小鼠中均能诱导头抽动反应。 DOI在mPFC L5a HTR2A+神经元中可逆地增加放电频率，且该效应可被MDL100907（200 nM）阻断。 行为实验中使用了不同基因型和性别的动物数量，具体见补充表3。
摘要
迷幻药，如麦角酸二乙酰胺和裸盖菇素，已成为治疗多种神经精神疾病（包括抑郁症、焦虑症、创伤后应激障碍、偏头痛和丛集性头痛）的潜在变革性疗法。经典迷幻药通过激活5-羟色胺2A受体（HTR2A）发挥作用。在此，我们提供了一套工程小鼠，将有助于阐明HTR2A在迷幻药作用中的作用。我们培育了Htr2aEGFP-CreERT2小鼠，以鉴定HTR2A-EGFP-CT受体和含有HTR2A的细胞，从而揭示HTR2A在大脑中的分布。我们还培育了人源化Htr2aA242S−EGFP-Cre和组成型Htr2aCre小鼠。迷幻药诱导的这些小鼠的行为变化验证了它们在这些研究中的效用。对这些小鼠脑片的电生理研究表明，2,5-二甲氧基-4-碘苯丙胺可诱导基因鉴定的锥体神经元放电显著增加。这些小鼠品系是研究迷幻药在体内作用的分子、细胞、药理学、生理学、行为学及其他机制的重要工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过基因工程小鼠精确解析HTR2A在迷幻药作用中的分布、功能和机制？
- 核心机制
- HTR2A是迷幻药作用的关键靶点，迷幻药通过激活HTR2A引起皮层神经元放电改变和行为学变化。
- 主要证据
- 通过行为学实验（头抽动反应、运动活性、PPI）验证了工程小鼠中迷幻药的作用；电生理实验表明DOI可增加HTR2A+神经元放电。
- 研究意义
- 提供了可广泛应用的开放获取小鼠模型，用于研究HTR2A介导的迷幻药作用机制及新药筛选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HTR2A全脑分布图谱绘制
确定HTR2A在脑区中的精确分布，以探讨其在不同神经回路中的功能。
通过免疫染色和光片显微镜观察Htr2aEGFP-CreERT2小鼠全脑切片和全脑透明化样本，结合AChE染色和MOR共标记确定核团边界。
HTR2A功能及调控的生化验证
确认EGFP插入不影响HTR2A的结合、定位和下调调控。
通过同源竞争结合实验测定Kd和Bmax，用RT-qPCR检测mRNA水平，通过Western blot检测LSD处理后的受体蛋白下调，并利用免疫染色观察亚细胞定位。
行为学表型评估
评估迷幻药在工程小鼠中的行为学效应，验证其对HTR2A介导作用的保留。
在开放场中测试运动活动（自发活动、饲养、刻板行为），记录头抽动反应、修饰和倒退行走，以及前脉冲抑制（PPI）测试。
电生理记录与神经活性检测
研究HTR2A+ L5a锥体神经元在迷幻药作用下的放电变化及HTR2A介导机制。
在Htr2aEGFP-CreERT2×Ai9小鼠中，通过tdTomato标记HTR2A+神经元，使用膜片钳记录电流钳模式下的放电频率，观察DOI和MDL100907的影响。
化学遗传学调控
验证Htr2aCre小鼠可用于化学遗传学操控HTR2A神经元活性。
在Htr2a+/Cre小鼠mPFC注射DIO-hM3Dq病毒，表达HA-hM3Dq后电极记录检测DCZ引起的膜电位变化。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 小鼠品系构建 | Cas9蛋白 | -- | -- |
| pET-28a(+)载体 | Novagen/Sigma-Aldrich | -- | |
| T7核酸内切酶I | New England Biolabs | -- | |
| 行为实验 | DOI | Tocris Bioscience | -- |
| LSD | -- | -- | |
| psilocin | -- | -- | |
| N,N-二甲基乙酰胺 | Sigma-Aldrich | 127-19-5 | |
| 2-羟丙基-β-环糊精 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 电生理实验 | MDL100907 | Sigma-Aldrich | -- |
| 分子实验 | TRIzol | Thermo Fisher | -- |
| RT-qPCR | TaqMan Fast Virus 1-Step预混液 | Thermo Fisher | -- |
| Western blot | WGA偶联琼脂糖珠 | Vector Laboratories | -- |
| 抗HTR2A抗体 | Neuromics | -- | |
| 免疫染色 | 抗GFP抗体 | Rockland | -- |
| 抗核糖体蛋白S6抗体 | Santa Cruz Biotechnology | -- | |
| 抗兔MOR抗体 | -- | -- | |
| 行为实验 | 旷场实验箱 | Omnitech Electronics | -- |
| SR-LAB仪器 | San Diego Instruments | -- | |
| 电生理实验 | 振动切片机 | Leica Microsystems | -- |
| 光片显微成像 | 光片显微镜 | LifeCanvas | -- |
| 图像采集 | 奥林巴斯VS120切片扫描仪 | Olympus | -- |
| 奥林巴斯FV3000RS共聚焦显微镜 | Olympus | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠品系构建 | 供体载体设计和CRISPR靶向策略（包括sgRNA序列） 阅读提示：Methods: Design for knock-in mice |
| HTR2A分布检测 | 使用Htr2aEGFP-CreERT2小鼠，抗GFP抗体放大信号；脑片厚度和通透条件需要参照原文 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry; Figure 2 |
| 受体结合实验 | 使用3H-ketanserin，浓度1.2 nM，冷配体竞争梯度；实验温度和时间 阅读提示：Methods: Homologous competition binding assay; Figure 3a |
| LSD诱导的受体下调 | LSD给药剂量0.5 mg/kg，i.p.，连续5天，然后在24小时后取样 阅读提示：Methods: HTR2A downregulation; Figure 3c |
| 行为学实验 | 药物剂量：LSD 0.3 mg/kg，DOI 1 mg/kg，psilocin 1 mg/kg，i.p.；给药后立即测试，运动活动记录90分钟，HTR记录30分钟；PPI在给药后30分钟测试 阅读提示：Methods: Behavioral testing; Figure 4 |
| 电生理实验 | 他莫昔芬100 mg/kg i.p.，连续4天，注射后14天进行记录；急性脑片厚度300 μm；使用Htr2a+/EGFP-CreERT2 x Ai9小鼠；tdTomato阳性神经元靶向 阅读提示：Methods: Electrophysiology; Figure 5 |