建立携带耐药亚克隆的混合肿瘤模型
模拟肿瘤内存在少量对G12Ci不敏感亚克隆的临床场景
将KPAR1.3 KRAS G12C（eBFP标记）和KRAS G12D（Luc-eGFP标记）细胞以不同比例（包括0.04%耐药细胞）皮下共接种于免疫健全（GH）小鼠，或在免疫缺陷Rag1-/-小鼠中接种。
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KRAS抑制剂诱导的癌细胞死亡增强对耐药亚克隆免疫介导旁观者杀伤的敏感性
KRAS Inhibitor-Induced Cancer Cell Death Enhances Sensitivity to Immune-Mediated Bystander Killing of Drug-Resistant Subclones
实验完整度
高研究包含体外细胞系实验、体内混合肿瘤模型、免疫缺陷小鼠实验、RNA-seq、多重免疫组化、流式等多层级验证，并进行了CD8+T细胞和B细胞清除实验。
摘要
针对KRAS G12C突变的治疗方法的临床获益在很大程度上受到通过多种机制产生的耐药性的限制。因此，要使这些疗法获得持久获益，需要有效的策略来应对耐药性的演变。为了研究这一点，我们开发了一种模拟对KRAS G12C抑制剂（如adagrasib和RMC-4998）产生耐药性的临床前模型。对含有少量耐药癌细胞亚群的肿瘤用G12Ci治疗导致其快速生长，在几周内取代药物敏感细胞。然而，将G12Ci与增强免疫反应的疗法（如抗PD-1或SHP2抑制剂）联合使用，可导致耐药细胞被清除并获得持久的完全缓解，尽管在缺乏药物敏感细胞的情况下，抗PD-1或SHP2抑制剂单药治疗并不能诱导耐药肿瘤消退。这种在靶向药物敏感细胞后对耐药细胞的旁观者杀伤依赖于完整的适应性免疫系统。在机制上，这些联合疗法导致肿瘤免疫微环境的深度重塑，使其免疫抑制性降低，并促进癌细胞死亡，从而引发免疫反应，伴有识别G12Ci耐药和敏感癌细胞共有肿瘤相关抗原的细胞毒性T淋巴细胞的涌入。促进免疫介导的耐药细胞的旁观者消除可能为解决癌症耐药性问题提供一种范例。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
单药与联合治疗评估
比较G12Ci单药与G12Ci联合抗PD-1或SHP2i对混合肿瘤生长及耐药细胞动态的影响
携带混合肿瘤的小鼠接受G12Ci（RMC-4998）单药或与SHP2i（RMC-4550）或抗PD-1联合治疗，期间测量肿瘤体积、生物发光信号，并在治疗结束时通过流式细胞术分析耐药细胞比例。
验证免疫记忆和适应性免疫依赖
确定联合治疗诱导的完全缓解是否依赖于适应性免疫并产生免疫记忆
对达到完全缓解的小鼠在另一侧皮下再次接种耐药细胞（KPAR1.3 G12D或KPAR.E2），观察排斥或生长延缓。同时，在Rag1-/-免疫缺陷小鼠中重复混合肿瘤治疗实验，观察肿瘤生长和耐药细胞动态。
免疫微环境分析
评估治疗如何重塑肿瘤微环境，包括免疫细胞浸润和表型
通过流式细胞术和多重免疫组化分析治疗后肿瘤中的免疫细胞亚群，包括CD8+ T细胞、CD4+ T细胞、巨噬细胞极化状态、NK细胞等。
转录组分析耐药细胞
研究治疗对耐药细胞基因表达的影响，特别是炎症相关通路
从混合肿瘤中分选G12C（eBFP+）和G12D（eGFP+）癌细胞进行bulk RNA-seq，分析差异表达基因和GSEA通路富集，重点关注干扰素应答和炎症信号。
确定免疫效应细胞类型
鉴定介导旁观者杀伤的免疫细胞类型
在免疫健全小鼠中，分别使用抗CD8或抗CD20抗体清除CD8+ T细胞或B细胞，然后对混合肿瘤进行联合治疗，观察完全缓解率和肿瘤生长。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200072 | |
| 药物处理 | RMC-4998 | Revolution Medicines | -- |
| RMC-4550 | Revolution Medicines | -- | |
| 阿达格拉西布 | MedChemExpress | -- | |
| 曲美替尼 | Selleck Chemicals | -- | |
| 米托蒽醌 | Selleck Chemicals | -- | |
| 免疫检测 | Lumit HMGB1免疫检测试剂盒 | Promega | W6112 |
| 流式细胞术 | 肿瘤解离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-096-730 |
| ACK裂解缓冲液 | Gibco | A1049201 | |
| 抗小鼠CD16/CD32抗体 | BD Biosciences | 553141 | |
| Zombie NIR活力染料 | -- | -- | |
| T-select H-2Kb MuLV p15E四聚体-KSPWFTTL | MBL | MBL-TS-M507-1 | |
| DRAQ7染料 | -- | -- | |
| Cytek Aurora光谱流式细胞仪 | Cytek | -- | |
| BD LSRFortessa X-20细胞分析仪 | BD Biosciences | -- | |
| 蛋白质印迹 | cOmplete Mini蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- |
| PhosSTOP磷酸酶抑制剂 | Roche | -- | |
| NuPAGE LDS上样缓冲液 | Invitrogen | NP0007 | |
| NuPAGE 4%-12% Bis-Tris凝胶 | Invitrogen | -- | |
| PVDF膜 | Merck Millipore | -- | |
| RNA提取和qPCR | RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | -- |
| Maxima第一链cDNA合成试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Fast SYBR Green试剂 | Applied Biosystems | -- | |
| 质粒构建和转染 | pLARRY-eGFP质粒 | Addgene | 140025 |
| pFUGW-FerH-ffLuc2-eGFP质粒 | Addgene | 71393 | |
| In-Fusion Snap Assembly预混液 | TaKaRa | 638947 | |
| jetPRIME转染试剂盒 | Polyplus | 101000015 | |
| 荧光检测 | CellTiter-Blue试剂 | Promega | G8081 |
| EnVision 2105多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| EnSight多功能酶标仪 | PerkinElmer | -- | |
| 活细胞成像 | Incucyte S3活细胞成像系统 | Sartorius | -- |
| 体内成像 | XenoLight D-荧光素 | PerkinElmer | 122799 |
| IVIS SpectrumCT成像系统 | PerkinElmer | -- | |
| 体内药物配制 | Captisol | Ligand | -- |
| 体内治疗 | 抗PD-1抗体(RMP1-14) | Bio X Cell | -- |
| 肿瘤组织解离 | MACS SmartStrainer过滤器 | Miltenyi Biotec | 130-110-916 |
| magnetic cell separation | CD45磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-052-301 |
| RNA-seq | RNeasy微量试剂盒 | Qiagen | 74004 |
| NEBNext Ultra II Directional PolyA mRNA试剂盒 | New England Biolabs | -- | |
| Watchmaker mRNA文库制备试剂盒 | Watchmaker | -- | |
| Illumina NovaSeq X测序平台 | Illumina | -- | |
| 免疫组化 | 抗eGFP/eBFP抗体 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 抗CD4抗体 | Abcam | -- | |
| 抗剪切型Caspase 3抗体 | Cell Signaling Technology | -- | |
| 抗CD8a抗体 | Abcam | -- | |
| 抗荧光素酶抗体 | Novus Biologicals | -- | |
| 抗Ki67抗体 | Abcam | -- | |
| Opal染料 | Akoya | -- | |
| PhenoImager HT扫描仪 | Akoya | VP2143N2122 | |
| 细胞活力检测 | DAPI染料 | -- | -- |
| 抗体检测 | FITC标记的抗小鼠IgG抗体 | BioLegend | 406001 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 混合肿瘤模型建立 | 细胞系、标记（eBFP和Luc-eGFP）、混合比例、接种细胞数、小鼠品系 阅读提示：Methods: 'Generating reporter-traced KPAR1.3 cell lines', 'In vivo techniques', Figure 1B |
| 药物处理 | G12Ci（RMC-4998）剂量、给药方式；SHP2i（RMC-4550）剂量；抗PD-1剂量 阅读提示：Methods: 'In vivo techniques' |
| 联合治疗效果评估 | 治疗周期、肿瘤体积测量、生物发光成像时间点、完全缓解定义 阅读提示：Results: 'Combination therapies enhance treatment responses and promote elimination of G12Ci-resistant subpopulations', Figures 2C-E |
| 免疫微环境分析 | 肿瘤解离方法、抗体染色panel、流式细胞仪设置、免疫细胞亚群定义 阅读提示：Methods: 'Flow cytometric techniques', 'Multiplex immunohistochemistry', Supplementary Figures S1, S2 |
| RNA-seq分析 | 肿瘤处理时间、细胞分选策略、RNA提取方法、测序深度 阅读提示：Methods: 'Bulk RNA sequencing', Results: 'Combination therapies increase inflammatory-associated signatures in G12Ci-resistant cells' |