生物信息学分析EP300表达和预后
分析EP300在不同肿瘤及头颈鳞癌中的表达水平以及与预后的关联。
使用TIMER和GEPIA2.0数据库，基于TCGA和GTEx数据分析EP300在多种肿瘤中的表达，以及在头颈鳞癌（HNSCC）与正常组织中的差异表达，并分析其与临床分期和预后的关联。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
抑制EP300/Notch信号通路调节口腔鳞状细胞癌的增殖与凋亡
Inhibition of the EP300/Notch Signaling Pathway Regulates Proliferation and Apoptosis in Oral Squamous Cell Carcinoma
实验完整度
高包含细胞系模型（CAL-27等）体外实验，涵盖增殖、凋亡、周期、迁移、EMT及机制验证（Notch通路蛋白检测及VPA救援实验），并整合数据库分析。
主要模型
口腔鳞状细胞癌细胞系 CAL-27 口腔鳞状细胞癌细胞系 HSC-3 口腔鳞状细胞癌细胞系 FADU 人正常口腔角质形成细胞 HOK
重点核对
EP300敲低效率：利用慢病毒转染及嘌呤霉素筛选，RT-qPCR和蛋白质印迹验证，shEP300#2敲低效果最佳 细胞增殖检测：CCK-8实验，1000细胞/孔接种96孔板，分别在0、24、48、72小时检测 细胞周期和凋亡检测：流式细胞术，使用细胞周期检测试剂盒（KeyGEN BioTECH），分析G0/G1期和凋亡比例 Notch通路激活：2 mmol/L VPA处理24小时，验证对Notch1、Hes1、Hey1等蛋白表达的影响 EMT和转移评估：蛋白质印迹检测E-cadherin、N-cadherin、vimentin及MMP-9；划痕实验和Transwell实验验证迁移和侵袭能力
摘要
目的：口腔鳞状细胞癌（OSCC）具有高复发和高转移特性；EP300驱动肿瘤发生，但其机制尚不清楚。材料与方法：通过数据库、RT‐PCR和Western blot分析EP300在OSCC中的表达。通过CCK‐8、集落形成实验检测敲低EP300对增殖的影响，通过流式细胞术检测细胞周期和凋亡。使用丙戊酸（VPA）激活Notch信号进行救援实验，探讨EP300与Notch之间的相互作用。结果：我们的实验结果显示EP300在OSCC细胞系中上调。此外，生物信息学分析显示EP300上调与OSCC的不良预后显著相关。先前的研究和生物信息学分析表明，EP300与OSCC中Notch信号通路的激活密切相关。在敲低EP300的OSCC细胞中给予VPA处理后，我们的结果表明VPA可以部分逆转EP300敲低对OSCC细胞增殖、细胞周期、凋亡及EMT过程的影响。结论：本研究发现EP300敲低抑制了Notch信号通路，从而抑制OSCC细胞增殖、细胞周期和EMT，同时促进凋亡。这些发现提示EP300对OSCC细胞的生长和发育至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EP300是否通过调节Notch信号通路影响口腔鳞状细胞癌的增殖和凋亡等恶性表型？
- 核心机制
- EP300在OSCC中高表达并激活Notch信号通路，通过上调Notch1、Hes1、Hey1等Notch靶基因，促进细胞增殖、周期进展和EMT，同时抑制细胞凋亡。
- 主要证据
- 数据库分析显示EP300高表达与不良预后相关；CAL-27等OSCC细胞系中敲低EP300后，CCK-8和克隆形成实验显示增殖能力下降，流式细胞术显示G0/G1期阻滞和凋亡增加，蛋白质印迹显示EMT相关蛋白改变（E-cadherin上调，N-cadherin、vimentin和MMP-9下调），Notch通路蛋白表达降低；VPA救援实验部分逆转了上述效应。
- 研究意义
- 揭示EP300通过Notch信号通路调控OSCC进展的新机制，为OSCC治疗提供了潜在靶点EP300/Notch，并为未来治疗策略的开发奠定理论基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证EP300在OSCC细胞系中的表达
验证EP300在OSCC细胞系及正常角质形成细胞中的mRNA和蛋白表达差异。
采用RT-qPCR和Western blot检测CAL-27、HSC-3、FADU细胞系与人正常口腔角质形成细胞（HOK）中EP300的表达。
构建EP300稳定敲低的OSCC细胞系
建立EP300基因沉默的CAL-27细胞模型，并验证敲低效率。
使用慢病毒（GeneCopoeia合成）转染CAL-27细胞，经绿色荧光蛋白筛选及嘌呤霉素（2 μg/mL，后用4 μg/mL）处理，建立稳定敲低EP300的细胞系（shEP300）。通过RT-qPCR和Western blot验证敲低效率。
评估EP300敲低对细胞增殖、迁移和侵袭的影响
检测EP300敲低后OSCC细胞增殖、克隆形成、迁移和侵袭能力的变化。
使用CCK-8实验检测细胞增殖；克隆形成实验检测克隆能力；划痕实验和Transwell实验检测迁移和侵袭能力。
检测EMT相关蛋白表达
探究EP300敲低对OSCC细胞上皮-间质转化（EMT）标志物表达的影响。
Western blot检测EMT相关蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-9）的表达水平。
分析EP300敲低对细胞周期和凋亡的影响
检测EP300敲低对OSCC细胞周期分布和凋亡比例的影响。
通过流式细胞术分析细胞周期（碘化丙啶染色）和细胞凋亡（Annexin V/PI染色？文中未明确），并Western blot检测周期相关蛋白（Cyclin D1、CDK4）和凋亡相关蛋白（Bcl-2、Bax、p53、Cleaved-Caspase3等）的表达。
验证EP300与Notch信号通路的关联
验证EP300敲低对Notch信号通路蛋白表达的影响，并明确EP300是否通过该通路调控细胞功能。
Western blot检测Notch通路相关蛋白（Notch1、Hes1、Hey1）表达；随后用VPA（Notch通路激活剂）处理NC和shEP300细胞，通过CCK-8、克隆形成、划痕、Transwell和Western blot检测细胞增殖、迁移、侵袭、EMT、周期和凋亡的改变。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证细胞功能变化
验证信号通路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| MEM培养基 | Biological Industries, Israel | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Biological Industries, Israel | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 药物处理 | 丙戊酸 | Glpbio | -- |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | Solarbio | -- |
| 细胞转染 | 嘌呤霉素 | Solarbio, China | -- |
| RNA提取 | Trizol试剂 | Thermo Fisher Science, America | -- |
| RT-PCR | SYBR荧光染料 | Roche | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio, China | -- |
| 蛋白酶抑制剂 | Solarbio, China | -- | |
| 磷酸酶抑制剂 | Solarbio, China | -- | |
| BCA蛋白浓度测定试剂盒 | Solarbio, China | -- | |
| PVDF膜 | Millipore, America | -- | |
| ECL增强化学发光试剂盒 | -- | -- | |
| 抗KAT3B/p300抗体 | -- | AF5360 | |
| GAPDH抗体 | -- | AF7021 | |
| β-肌动蛋白抗体 | -- | AF7018 | |
| 波形蛋白抗体 | -- | AF7013 | |
| E-钙黏蛋白抗体 | -- | AF0131 | |
| N-钙黏蛋白抗体 | -- | AF5239 | |
| MMP-9抗体 | -- | AF5228 | |
| HES1抗体 | -- | DF7569 | |
| Bcl-2抗体 | -- | AF6139 | |
| Bax抗体 | -- | AF0120 | |
| p53抗体 | -- | AF0879 | |
| Cleaved-Caspase 3抗体 | -- | AF7022 | |
| Caspase 3抗体 | -- | AF6311 | |
| Notch1抗体 | Proteintech | 20687-1-AP | |
| Hey1抗体 | Proteintech | 19929-1-AP | |
| Cyclin D1多克隆抗体 | Upingbio | YP-Ab-16725 | |
| CDK4多克隆抗体 | Upingbio | YP-Ab-16791 | |
| 辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (H+L) | -- | S0001 | |
| CCK-8检测 | CCK-8试剂盒 | Vazyme, China | -- |
| 细胞周期检测 | 细胞周期检测试剂盒 | KeyGEN BioTECH, China | -- |
| 核糖核酸酶A | -- | -- | |
| 碘化丙啶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（CAL-27由ATCC获取）、培养基成分（DMEM、10% FBS、1%青霉素-链霉素）、培养条件（37°C、5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Materials and Reagents 和 2.2 Cell Culture |
| EP300敲低 | 慢病毒载体（GeneCopoeia合成）、嘌呤霉素筛选浓度（2 μg/mL和4 μg/mL）、shRNA序列（见表S1） 阅读提示：Materials and Methods 2.3 Cell Transfection |
| VPA处理 | VPA浓度（2 mmol/L）、处理时间（24小时）、溶剂DMSO终浓度（低于千分之一） 阅读提示：Materials and Methods 2.2 Cell Culture 和 2.10 |
| 细胞增殖检测 | CCK-8实验：细胞接种数（1000细胞/孔），检测时间点（0、24、48、72小时） 阅读提示：Materials and Methods 2.6 CCK-8 Detection |
| 细胞周期与凋亡检测 | 流式细胞术检测周期与凋亡，所用染色试剂、细胞周期试剂盒（KeyGEN BioTECH） 阅读提示：Materials and Methods 2.7 Cell Cycle Detection by Flow Cytometry 和 Figure 4 图注 |
| EMT检测 | Western blot检测EMT标志蛋白（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、MMP-9） 阅读提示：Materials and Methods 2.5 Western Blot Analysis 和 Results 3.3 |