光片显微镜3D成像
观察完整组织中癌前病变与浸润癌的结构关系
对患者组织块进行透明化和免疫染色，使用光片显微镜成像，分析CK5和PanCK标记的基底细胞和上皮细胞。
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乳腺癌和前列腺癌癌前至癌症转变的空间图谱
Spatial Mapping of the Precancer-to-Cancer Transition in Breast and Prostate
实验完整度
高包含空间转录组与多重成像、患者样本、光片3D成像、细胞系功能验证等多层级证据，并验证关键基因功能。
主要模型
乳腺癌患者组织（DCIS、IDC） 前列腺癌患者组织（正常、HGPIN、GP3） 患者来源DCIS细胞系ETCC-006和ETCC-010 PC-3前列腺癌细胞系
重点核对
样本类型：乳腺癌和前列腺癌组织，包括DCIS、IDC、HGPIN、GP3等形态区域 空间平台：Xenium、CosMx、Visium、Visium HD、CODEX等 基因敲低：shRNA介导的MGP、PLAT（乳腺癌）和GDF15、FASN、ALDH1A3、ANPEP（前列腺癌） 功能检测：CCK-8增殖实验（24-120小时）和划痕愈合实验（24或72小时） 统计分析：Student t检验（双侧），P值报告
摘要
乳腺癌和前列腺癌都是激素驱动的腺癌，经历类似的侵袭程序。利用光片显微镜对完整肿瘤进行成像，我们鉴定了癌前区域与浸润区域之间的过渡连接。随后，我们开发了一种多模态连续切片工作流程，整合体积重建与空间转录组学。对来自51例病例的319项空间检测的分析揭示了基因表达特征和新的结构见解，定义了从癌前到浸润性疾病的转变。在乳腺癌中，MGP和PLAT的缺失与浸润性转变相关，并在功能实验中促进了肿瘤发生。在前列腺癌中，GDF15、ALDH1A3、ANPEP和FASN沿浸润性进展上调，在PC-3细胞中敲低这些基因抑制了增殖和迁移。肿瘤相关巨噬细胞（SPP1+和MS4A6A+）沿非三阴性乳腺癌转变的富集突出了免疫参与作为侵袭性的潜在驱动因素。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 乳腺癌和前列腺癌从癌前状态（DCIS/HGPIN）进展为浸润性癌（IDC/GP3）过程中，空间结构和分子特征如何变化？
- 核心机制
- 乳腺癌中MGP和PLAT的表达缺失促进肿瘤发生和侵袭；前列腺癌中GDF15、ALDH1A3、ANPEP和FASN的上调驱动增殖和迁移。此外，SPP1+巨噬细胞在非三阴性乳腺癌的侵袭前沿富集，提示免疫微环境参与侵袭。
- 主要证据
- 利用光片显微镜显示3D结构中DCIS与IDC或HGPIN与GP3的连续转变；结合319项空间检测，通过路径和形态学方法鉴定差异表达基因；在患者来源细胞系和PC-3细胞中通过shRNA敲低验证MGP、PLAT及GDF15等基因的功能。
- 研究意义
- 该研究精确界定侵袭转变的空间位置，有助于直接研究转变驱动因素，为乳腺癌和前列腺癌提供新的治疗靶点，并为研究肿瘤进展的空间机制提供框架。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
多模态连续切片空间分析
整合不同空间平台数据，重建3D结构并发现转变相关基因
对组织块进行连续切片，使用Xenium、CosMx、CODEX、Visium和Visium HD平台进行空间转录组和蛋白检测，并进行计算配准。
差异基因发现
鉴定与DCIS至IDC或正常至GP3转变相关的基因
使用path-based和morphology-based方法计算基因表达变化，并利用2D自动和手动方法补充。
免疫微环境分析
研究肿瘤相关巨噬细胞和成纤维细胞在转变中的空间分布
基于空间转录组数据，分析SPP1+和MS4A6A+ TAMs及MFAP5+和ASPN+ CAFs与不同形态区域的关系。
功能验证
验证关键基因对细胞增殖和迁移的影响
在乳腺癌细胞系ETCC-006和ETCC-010中敲低MGP或PLAT，在前列腺癌细胞系PC-3中敲低GDF15、FASN、ALDH1A3和ANPEP，然后进行增殖和划痕愈合实验。
蛋白水平验证
在组织水平验证关键基因的蛋白表达
使用免疫荧光（IF）和CODEX对MGP、PLAT、GDF15、ALDH1A3等蛋白进行染色和定量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 空间转录组库构建 | Visium空间基因表达玻片 | 10x Genomics | -- |
| 空间转录组测序 | NovaSeq-6000 | Illumina | -- |
| Xenium空间转录组 | Xenium分析仪 | 10x Genomics | 1000481 |
| 人类多组织和癌症panel | 10x Genomics | 1000626 | |
| Xenium Prime空间转录组 | Xenium Prime 5K人类泛组织和通路panel | 10x Genomics | 1000724 |
| CosMx空间转录组 | CosMx SMI | Bruker Spatial Biology | -- |
| CosMx 1K Discovery Panel | Bruker Spatial Biology | -- | |
| CosMx 6K Discovery Panel | Bruker Spatial Biology | -- | |
| 光片显微镜 | Ultra Microscope Blaze | Miltenyi | -- |
| EasyIndex折射率匹配介质 | LifeCanvas Technologies | -- | |
| 组织透明化 | SmartBatch+ ETC主动组织透明化平台 | LifeCanvas Technologies | -- |
| 光片显微镜 | SHIELD多聚环氧 | -- | -- |
| Hoechst | -- | -- | |
| 免疫荧光验证 | anti-CK5抗体 | -- | AB_2538529 |
| anti-PanCK抗体 | -- | AB_10942225 | |
| anti-ANPEP抗体 | Abcam | AB_10866195 | |
| anti-ALDH1A3抗体 | Abcam | AB_2937054 | |
| anti-FASN抗体 | Abcam | AB_732316 | |
| anti-GDF15抗体 | Abcam | AB_3099455 | |
| anti-EPHA6抗体 | LSBio | AB_3741541 | |
| anti-E-cadherin抗体 | R&D Biosystems | AB_355568 | |
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Gibco | 11875093 |
| 胎牛血清 | Gibco | 16140071 | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140122 | |
| 聚凝胺 | Sigma-Aldrich | TR-1003-G | |
| 嘌呤霉素 | Sigma-Aldrich | P8833 | |
| RNA提取与qPCR | RNA提取试剂盒 | Invitrogen | -- |
| High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | BIO-RAD | 1725121 | |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 移码实验 | MycoAlert支原体检测试剂盒 | Lonza | LT07-318 |
| 显微镜 | Keyence荧光显微镜BZ-X810 | Keyence | -- |
| 组织切片 | Superfrost Plus玻片 | -- | -- |
| 免疫荧光染色 | VectaMount AQ水溶性封片剂 | Southern Biotech | H-5501-60 |
| Tris-EDTA缓冲液pH9 | Novus | NB900-62085 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 光片显微镜3D成像 | 样本固定、透明化、抗体浓度、成像参数 阅读提示：Methods: Tissue Clearing, Staining, and Imaging for 3D Lightsheet |
| 空间转录组分析 | 切片厚度、平台选择、探针panel（基因数）、测序深度 阅读提示：Methods: Visium/Xenium/CosMx 部分 |
| 差异基因分析 | ROI选择标准、形态学注释、统计方法、阈值 阅读提示：Methods: Gene Discovery Overview, 3D Gene Discovery |
| 细胞功能验证 | 细胞系、shRNA序列、转染条件、增殖和迁移实验时间点 阅读提示：Methods: Breast and Prostate Cancer Proliferation and Migration Assays |
| 蛋白水平验证 | 抗体编号、稀释比例、抗原修复、成像 阅读提示：Methods: IF Validation |