Protective Effect of Calcitonin Gene-Related Peptide on Corneal Epithelial Barrier in Experimental Dry Eye Models
研究包含体内小鼠模型和体外细胞模型两个独立证据层级，并通过功能验证（屏障功能测定）和机制验证（Western blot、免疫荧光检测信号通路）明确验证了CGRP的保护作用。
BAC诱导的干眼小鼠模型 高渗应激的人角膜上皮转化细胞（HCE-T）模型
BAC浓度为0.05%，每天两次，处理4或7天 CGRP给药浓度为50 µM，每天三次，处理4天 体外高渗培养基为500 mOsm，CGRP浓度为10−6 M，处理24小时 CGRP受体表达变化（CRLR、RAMP-1、CRCP）和信号通路分子p-PKACα、p-CREB、p-p65
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
在BAC诱导的小鼠干眼模型和高渗应激的HCE-T细胞中，验证模型建立并检测CGRP表达及受体变化。
使用0.05% BAC滴眼诱导小鼠干眼模型，持续4或7天；使用高渗培养基（500 mOsm）处理HCE-T细胞。通过角膜荧光素钠染色、酚红棉线试验、角膜敏感度测定、PAS染色评估模型，并通过whole-mount染色和Western blot检测CGRP水平，利用qPCR和免疫荧光检测CGRP受体组分。
在BAC诱导的干眼小鼠和高渗应激的HCE-T细胞中，检验外源性CGRP是否改善角膜上皮屏障功能障碍。
对BAC诱导的小鼠给予局部CGRP（50 µM）或PBS处理，通过OGD染色评估角膜屏障功能，并通过TEER检测体外细胞的屏障功能。同时，分析紧密连接蛋白（ZO-1、occludin、E-cadherin）的表达和分布。
在体外和体内模型中，验证CGRP是否通过PKA/CREB和NF-κB通路发挥屏障保护作用。
在体外高渗应激的HCE-T细胞中，用CGRP处理30分钟后，利用Western blot检测p-PKACα、p-CREB和p-p65水平，通过免疫荧光观察p65核转位，并通过qPCR检测炎性因子（IL-1β、TNF-α、IL-6、MMP-9）mRNA表达。在BAC诱导的干眼小鼠中，同样检测这些指标。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型诱导 | 苯扎氯铵 | -- | -- |
| 干预处理 | α-降钙素基因相关肽 | MedChemExpress | HY-P0203 |
| 屏障功能测定 | Oregon Green葡聚糖，70,000 MW | Thermo Fisher Scientific | D7172 |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | MedChemExpress | -- | |
| 青霉素/链霉素 | BioSharp | -- | |
| 重组人表皮生长因子 | Gibco | -- | |
| 抗体（免疫荧光） | 抗β3-微管蛋白Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | 53-4510-82 |
| 抗ZO-1 | Thermo Fisher Scientific | 33-9100 | |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG H&L | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Alexa Fluor 568山羊抗兔IgG H&L | Thermo Fisher Scientific | A11011 | |
| 染色 | DAPI染色液 | ABclonal Technology | -- |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 牛血清白蛋白 | -- | -- | |
| 吐温-20 | -- | -- | |
| 抗α-CGRP抗体 | Cell Signaling Technology | 14959S | |
| 抗PKACα抗体 | ABclonal Technology | A18603 | |
| 抗p-PKACα-T197抗体 | ABclonal Technology | AP0557 | |
| 抗CREB抗体 | Proteintech | 12208-1-AP | |
| 抗p-CREB-S133抗体 | Proteintech | 28792-1-AP | |
| 抗p65抗体 | Proteintech | 10745-1-AP | |
| 抗p-p65抗体 | Proteintech | 80379-2-RR | |
| HRP偶联IgG抗体 | -- | -- | |
| 成像系统 | Molecular Imager ChemiDoc XRS成像系统 | Bio-Rad Laboratories | -- |
| 免疫荧光 | OCT包埋剂 | Sakura Finetek USA | 4583 |
| 抗RAMP-1抗体 | ABclonal Technology | A6447 | |
| 抗occludin抗体 | Abclonal | A25320 | |
| 抗E-钙黏蛋白抗体 | ABclonal Technology | A22333 | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 氯仿 | -- | -- | |
| TEER检测 | Transwell板 | Labselect; Beijing Labgic Technology Co. | 14311 |
| TEER测量仪 | Beijing Daxiang Biotech | MT100111 | |
| 统计分析 | GraphPad Prism 8 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 干眼模型建立 | BAC浓度及给药方案（0.05%，5µL每天两次）、处理持续时间（4天或7天）、小鼠品系（雌性C57BL/6J，8-10周龄）、环境条件（温度22-26℃，湿度60%±10%，光暗周期12小时） 阅读提示：Methods - Animal Model |
| CGRP干预 | CGRP浓度（50 µM）、给药次数（每天三次）、给药时长（4天）、给药体积（5µL）、对照组（PBS） 阅读提示：Methods - Animal Model |
| 屏障功能评估 | OGD浓度（50 mg/mL）、染色时间（1分钟）、清洗条件（5次PBS）；TEER测量使用Transwell板和背景电阻校正 阅读提示：Methods - Corneal Oregon Green Dextran Staining; Methods - Transepithelial Electrical Resistance Detection |
| 细胞实验 | HCE-T细胞培养条件（培养基、FBS浓度、EGF浓度等）、高渗应激条件（500 mOsm）、CGRP处理浓度（10−6 M）和处理时间（24小时） 阅读提示：Methods - Cell Culture |
| 信号通路检测 | 处理时间点（30分钟）用于检测磷酸化蛋白、抗体使用和稀释比例、qPCR引物序列 阅读提示：Methods - Western Blotting; Methods - Immunofluorescence Staining; Methods - RNA Extraction and Real-Time PCR |
