靶向α-Gal的人单克隆抗体限制IgE与α-Gal综合征过敏原的结合

Human monoclonal antibodies targeting α-Gal restrict IgE engagement of α-Gal syndrome allergens

作者信息Hyeseon Cho, Youngsil Seo, Haewon Sohn, Shailesh K Choudhary, Jeff Skinner, Ming Zhao, Ludmila Krymskaya, Weizhi Zhong, Justin Lack, Shanping Li, Boubacar Traore, Joshua Tan, Scott P Commins, Peter D Crompton

PMID42677844

期刊J Clin Invest

发布时间2026-09-01

DOI10.1172/JCI192370

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实验完整度

高

研究包含B细胞分选与单抗分离、体外结合与阻断实验、竞争分析与动力学检测、间接嗜碱性粒细胞活化试验等多个独立实验层级，并包含功能验证（阻断IgE、抑制细胞活化）和机制验证（表位竞争、亲和力分析）。

主要模型

人记忆B细胞来源的抗α-Gal单克隆抗体健康供者PBMC来源的嗜碱性粒细胞（经AGS患者血清致敏） α-Gal综合征患者血清样本疟疾暴露个体PBMC

重点核对

42株抗α-Gal单抗的IGHV3基因家族使用及突变频率 13株单抗对ACE、AP-N、西妥昔单抗的结合活性 AG028（IgA2/IgM）和AG050（IgA1）对AGS患者血清IgE结合的阻断效率 AG028抑制ACE介导的嗜碱性粒细胞活化的程度（供者依赖性） AGS患者血清IgE水平与ACE、AP-N、西妥昔单抗反应性的相关性

摘要

过敏原特异性单克隆抗体（mAbs）能够阻断IgE与过敏原的结合，正在成为治疗花粉、花生和猫过敏的新疗法。α-Gal综合征（AGS）是对哺乳动物肉类和组织来源产品中存在的半乳糖-α-1,3-半乳糖（α-Gal）的过敏反应。最初旨在识别靶向疟原虫上α-Gal的mAbs，我们从曾暴露于疟疾的个体的B细胞中分离出42个α-Gal特异性mAbs，但发现它们与恶性疟原虫的结合较弱。这些mAbs主要使用IGHV3基因家族，并具有广泛的突变频率。我们随后筛选了这些mAbs结合AGS过敏原上α-Gal的能力，以及阻断AGS患者血清IgE与AGS过敏原结合的能力。13个mAbs与AGS过敏原血管紧张素-I转换酶（ACE）、氨肽酶-N（AP-N）和西妥昔单抗结合，其中2个mAbs——AG028（IgA2和IgM形式）和AG050 IgA1——阻断了AGS患者血清IgE与ACE和AP-N的结合。此外，AG028 IgA2和AG028 IgM抑制了用AGS患者血清致敏的嗜碱性粒细胞中ACE介导的活化。本研究支持开发α-Gal特异性mAbs作为预防α-Gal过敏的新型干预措施。

从疟疾暴露个体中分离抗α-Gal单抗

获得靶向α-Gal的人单克隆抗体，用于后续对α-Gal综合征过敏原的交叉反应性评估。

选取18名具有高α-Gal抗体滴度的个体，从其PBMCs中分选出α-Gal特异性B细胞（使用α-Gal-HSA作为探针），经培养后筛选阳性克隆，并克隆表达42株重组人单抗。

评估抗α-Gal单抗对恶性疟原虫子孢子的结合

验证这些单抗是否能结合疟原虫子孢子表面的α-Gal，以评估其可能的中和或抑制作用。

将42株单抗及10株IgM变异体与活体恶性疟原虫子孢子孵育，通过流式细胞术检测结合情况；对强结合的AG062 IgM进一步用重组PfCSP蛋白及合成肽段检测其结合特异性。

筛选抗α-Gal单抗对AGS过敏原的结合

鉴定能结合α-Gal综合征相关过敏原（ACE、AP-N、西妥昔单抗）的单抗。

将13株单抗及4株重新表达的IgM变异体与ACE、AP-N、西妥昔单抗（F(ab')2片段）以及合成的α-Gal-BSA进行滴定结合实验，用AUC热图量化结合能力。

分析AGS患者血清对已知α-Gal过敏原的免疫球蛋白反应

表征AGS患者血清中针对ACE、AP-N、西妥昔单抗等过敏原的特异性IgE和IgG1-4水平，以确定这些过敏原的代表性。

用多重微球免疫测定法检测88例AGS患者和31例健康对照血清中针对ACE、AP-N、西妥昔单抗、牛奶过敏原（乳铁蛋白等）和明胶的IgE及IgG1-4水平；并用可溶性α-Gal竞争实验验证IgE结合的特异性。

评估抗α-Gal单抗阻断患者IgE结合过敏原的能力

确定能有效阻止AGS患者IgE与ACE、AP-N和西妥昔单抗结合的单抗，作为潜在的功能性阻断剂。

将13株单抗及4株IgM变异体与过敏原微球预孵育，然后加入患者血清（如UNC0209.1），检测IgE结合抑制率；随后用4个高反应性血清样本验证3个最有效的单抗（AG028 IgA2/IgM和AG050 IgA1）的抑制效果。

抗α-Gal单抗的竞争和结合动力学分析

阐明这些单抗识别的表位是否重叠，以及它们的亲和力特性。

利用荧光标记的AG028 IgA2和AG050 IgA1与未标记的抗体（包括AG056 IgG1和鼠源M86）进行竞争结合实验，计算IC50；并用生物层干涉法（BLI）测量Fab片段及完整IgA/IgM的亲和力。

评估抗α-Gal单抗抑制嗜碱性粒细胞活化

验证这些阻断单抗能否在细胞水平上抑制AGS过敏原（ACE、AP-N）诱导的嗜碱性粒细胞脱颗粒。

分离健康供者PBMC中的嗜碱性粒细胞，用乳酸去除内源IgE后，用AGS患者血清（P1或P2）过夜致敏；随后加入不同浓度的单抗预处理的ACE或AP-N（1 mg/mL）刺激，通过流式细胞术检测CD63阳性细胞比例。

比较来源于疟疾暴露个体与α-Gal综合征患者的单抗序列

探讨不同来源的α-Gal特异性抗体的序列相似性和进化关系。

将本研究分离的42株单抗重链VH序列与已报道的来自AGS患者的抗体（HKB7, HKD8, JEC1）和鼠源M86进行序列比对，使用Abalign和Geneious Prime构建无根距离树，并分析关键位置（如CDR3长度和Kabat 33位）的差异。

实验环节	名称	品牌	货号
抗体生产	Expi293F细胞	Thermo Fisher Scientific	A14527
ExpiCHO-S细胞	Thermo Fisher Scientific	A29127
B细胞分选	Gala1-3Galb1-4GlcNAc-HSA	Dextra	NGP2334
人血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A3782
抗体检测	APC标记的山羊抗人IgE多克隆抗体	Abcam	ab99898
AF647标记的山羊抗人IgM多克隆抗体	Jackson Immunoresearch	109-606-129
AF647标记的山羊抗人IgA多克隆抗体	Jackson Immunoresearch	109-606-011
流式细胞术	链霉亲和素	--	--
重链可变区序列分析	Abalign	--	--
Geneious Prime	--	--

实验环节

名称

品牌

货号

抗体生产

Expi293F细胞

Thermo Fisher Scientific

A14527

ExpiCHO-S细胞

Thermo Fisher Scientific

A29127

B细胞分选

Gala1-3Galb1-4GlcNAc-HSA

Dextra

NGP2334

人血清白蛋白

Sigma-Aldrich

A3782

抗体检测

APC标记的山羊抗人IgE多克隆抗体

Abcam

ab99898

AF647标记的山羊抗人IgM多克隆抗体

Jackson Immunoresearch

109-606-129

AF647标记的山羊抗人IgA多克隆抗体

Jackson Immunoresearch

109-606-011

流式细胞术

链霉亲和素

重链可变区序列分析

Abalign

Geneious Prime

环节	核对要点
B细胞分选与单抗生成	α-Gal-HSA探针的使用，B细胞分选门控策略，48个样本的B细胞培养条件（如IL-2、IL-21浓度、384孔板、细胞数量），单抗克隆表达系统（CHO或Expi293F）。阅读提示：https://doi.org/10.1172/JCI192370DS1中的补充材料，及Methods部分“Isolation, sequence analysis, and production of anti-α-Gal mAbs”
结合活性评估	过敏原（ACE、AP-N、西妥昔单抗、合成α-Gal）的来源和生物素化条件，单抗浓度梯度（1:4系列稀释），试剂盒（如Abcam生物素化试剂盒），检测抗体（AF647标记的抗人IgA/IgM）的克隆号或货号。阅读提示：Methods部分“AGS patient serum and mAb binding to AGS allergen”及Figure 2图注
竞争与亲和力测定	竞争实验中使用的AF647标记单抗浓度（AG028 IgA2 1 μg/mL, AG050 IgA1 4 μg/mL），竞争抗体的浓度范围（0.01 ng/mL至100 μg/mL），BLI传感器类型（链霉亲和素），分析物浓度设定（IgA/M：3.125-400 nM；Fab：0.75-48 μM），拟合模型。阅读提示：Methods部分“Competition assay of anti-α-Gal mAbs for AGS allergen binding”和“Biolayer interferometry kinetic binding assay”，以及Figure 6图注
IgE阻断实验	患者血清的选择（UNC0146.2等）和稀释度，单抗浓度（50 mg/mL）及预孵育时间，微球偶联时间，IgE检测抗体的选择（APC偶联抗人IgE），阻断率的计算方式。阅读提示：Methods部分“Interference of anti-α-Gal mAbs with AGS serum IgE binding to AGS allergens”
嗜碱性粒细胞活化试验	健康供者PBMC的处理（IgE剥离方法），致敏用AGS患者血清（P1, P2）及浓度，刺激物（ACE/AP-N）浓度（1 mg/mL）和孵育时间，单抗浓度（3.12-200 μg/mL），IL-3浓度（2 ng/mL），CD63+检测门控策略。阅读提示：Methods部分“Indirect basophil activation assay”以及Figure 7图注

环节

核对要点

B细胞分选与单抗生成

α-Gal-HSA探针的使用，B细胞分选门控策略，48个样本的B细胞培养条件（如IL-2、IL-21浓度、384孔板、细胞数量），单抗克隆表达系统（CHO或Expi293F）。

阅读提示：https://doi.org/10.1172/JCI192370DS1中的补充材料，及Methods部分“Isolation, sequence analysis, and production of anti-α-Gal mAbs”

结合活性评估

过敏原（ACE、AP-N、西妥昔单抗、合成α-Gal）的来源和生物素化条件，单抗浓度梯度（1:4系列稀释），试剂盒（如Abcam生物素化试剂盒），检测抗体（AF647标记的抗人IgA/IgM）的克隆号或货号。

阅读提示：Methods部分“AGS patient serum and mAb binding to AGS allergen”及Figure 2图注

竞争与亲和力测定

竞争实验中使用的AF647标记单抗浓度（AG028 IgA2 1 μg/mL, AG050 IgA1 4 μg/mL），竞争抗体的浓度范围（0.01 ng/mL至100 μg/mL），BLI传感器类型（链霉亲和素），分析物浓度设定（IgA/M：3.125-400 nM；Fab：0.75-48 μM），拟合模型。

阅读提示：Methods部分“Competition assay of anti-α-Gal mAbs for AGS allergen binding”和“Biolayer interferometry kinetic binding assay”，以及Figure 6图注

IgE阻断实验

患者血清的选择（UNC0146.2等）和稀释度，单抗浓度（50 mg/mL）及预孵育时间，微球偶联时间，IgE检测抗体的选择（APC偶联抗人IgE），阻断率的计算方式。

阅读提示：Methods部分“Interference of anti-α-Gal mAbs with AGS serum IgE binding to AGS allergens”

嗜碱性粒细胞活化试验

健康供者PBMC的处理（IgE剥离方法），致敏用AGS患者血清（P1, P2）及浓度，刺激物（ACE/AP-N）浓度（1 mg/mL）和孵育时间，单抗浓度（3.12-200 μg/mL），IL-3浓度（2 ng/mL），CD63+检测门控策略。

阅读提示：Methods部分“Indirect basophil activation assay”以及Figure 7图注

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