建立草酸钙肾病模型并评估芹菜素保护作用
确定芹菜素对乙醛酸盐诱导的CaOx肾损伤的缓解作用及其剂量依赖性。
小鼠腹腔注射乙醛酸盐建立CaOx肾病模型，口服不同剂量芹菜素，检测肾功（Cr、BUN）、组织学（PAS、von Kossa）、凋亡（TUNEL）。
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芹菜素通过激活AKT1协调MTOR介导的抗凋亡和FOXO3驱动的抗氧化防御在草酸钙肾病中的作用
Apigenin activates AKT1 to coordinate MTOR-mediated anti-apoptosis and FOXO3-driven antioxidant defense in calcium oxalate nephropathy
实验完整度
高整合网络药理学与机器学习预测，结合小鼠体内模型、HK-2细胞体外模型、SPR/CETSA/DARTS结合验证，及MK-2206/siRNA/过表达功能验证，多层级验证机制。
主要模型
草酸钙肾病小鼠模型（乙醛酸盐诱导的C57BL/6J雄性小鼠） HK-2人肾近端肾小管上皮细胞系（COM晶体处理）
重点核对
芹菜素给药剂量（10、25、50 mg/kg/d）及方式（口服，连续10天） 乙醛酸盐造模剂量（100 mg/kg/d，腹腔注射，第4-10天） MK-2206给药剂量（40 mg/kg/d，腹腔注射，芹菜素前1小时） HK-2细胞COM处理浓度2.0 nM，芹菜素预处理100 μM（2小时） si-AKT1敲低序列及转染效率验证
摘要
背景：肾结石疾病主要由草酸钙（CaOx）晶体组成，代表着一个重大的全球健康负担，且复发率高。目前的治疗策略未能充分解决CaOx晶体引发的肾小管细胞氧化应激和凋亡。虽然天然黄酮类化合物芹菜素（API）显示出前景，但其在CaOx肾病中的确切机制仍不清楚。方法：我们采用网络药理学和机器学习相结合的综合策略来鉴定芹菜素在肾结石疾病中的潜在治疗靶点。实验验证在体内和体外模型中进行：乙醛酸盐诱导的CaOx肾病小鼠模型和暴露于草酸钙一水合物晶体的HK-2细胞。通过表面等离子体共振、分子对接、细胞热位移测定和药物亲和响应靶标稳定性测定研究了芹菜素与AKT1之间的相互作用。使用定量PCR、Western印迹、活性氧测量和凋亡评估分析下游信号效应。使用特异性抑制剂MK-2206、siRNA介导的敲低和FOXO3过表达实验进一步检查了AKT1的功能作用。结果：芹菜素治疗显著减少了小鼠CaOx晶体沉积，改善了肾功能标志物，并减轻了肾小管损伤，呈剂量依赖性。生物信息学分析确定AKT1为核心靶点，实验验证证实芹菜素直接高亲和力结合AKT1，导致磷酸化增强。这种激活调节了两个关键的下游通路。mTOR通路通过下调BAX和上调BCL-2抑制凋亡；FOXO3的磷酸化降低了其对Keap1的转录活性，导致Keap1表达减少，随后Nrf2稳定、核转位以及抗氧化酶HO-1的上调。MK-2206和si-AKT1处理消除了芹菜素的保护作用，进一步支持了AKT1的必要作用。此外，FOXO3过表达逆转了芹菜素诱导的Nrf2激活，证实了AKT1-FOXO3-Keap1-Nrf2轴的参与。结论：芹菜素通过直接激活AKT1减轻CaOx诱导的肾损伤，AKT1协调双重保护机制：通过mTOR通路抗凋亡和通过FOXO3-Keap1-Nrf2轴抗氧化防御。本研究为芹菜素在CaOx肾病中以AKT1为中心的作用机制提供了全面证据，支持其作为肾结石疾病新型治疗剂的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 本研究探讨了芹菜素（API）是否通过直接靶向AKT1并协调下游信号通路来减轻草酸钙（CaOx）诱导的肾损伤，从而阐明其在肾结石病中的保护机制。
- 核心机制
- APID直接结合并激活AKT1，促进其Ser473和Thr308位点磷酸化，进而激活mTOR通路（抑制凋亡）和磷酸化FOXO3（抑制其转录活性），下调Keap1，稳定Nrf2并促进其核转位，上调HO-1，协同发挥抗凋亡和抗氧化作用。
- 主要证据
- 通过分子对接、CETSA、DARTS和SPR验证了API直接与AKT1高亲和力结合；体内外实验显示API剂量依赖性降低CaOx诱导的凋亡和ROS，MK-2206或si-AKT1消除保护作用，FOXO3过表达逆转Nrf2激活，证实了AKT1依赖的机制。
- 研究意义
- 该研究首次揭示API通过靶向AKT1协调mTOR/FOXO3双通路保护CaOx肾病，为肾结石预防提供新策略，并为天然产物防治肾结石提供理论和实验基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
网络药理学与机器学习预测核心靶点
预测芹菜素在肾结石疾病中的潜在治疗靶点，并筛选核心靶点。
整合多个数据库获取药物和疾病靶点，进行GO/KEGG分析，WGCNA和差异基因分析，结合LASSO、SVM、随机森林筛选核心靶点，并在GSE73680数据集中验证表达。
验证芹菜素与AKT1的直接结合
确认芹菜素是否直接结合AKT1并促进其激活。
分子对接预测结合模式；CETSA和DARTS检测细胞内结合；SPR测定亲和力；Western blot检测AKT1磷酸化及下游通路蛋白。
评估芹菜素对细胞凋亡和氧化应激的调控
探究芹菜素在CaOx诱导的损伤中是否发挥抗凋亡和抗氧化作用。
检测凋亡相关蛋白（BAX、BCL2、caspase-3）和抗氧化蛋白（Nrf2、HO-1）表达，测量ROS水平，流式分析凋亡。
验证AKT1/mTOR和AKT1/FOXO3通路在保护中的作用
确定AKT1下游通路是否介导了芹菜素的抗凋亡和抗氧化效果。
使用AKT1抑制剂MK-2206或siRNA敲低AKT1，检测p-AKT1、p-mTOR、p-FOXO3、cleaved-caspase-3、Nrf2、HO-1表达及ROS和凋亡水平。
阐明FOXO3-Keap1-Nrf2轴介导抗氧化机制
验证芹菜素通过抑制FOXO3活性下调Keap1，从而激活Nrf2的机制。
在HK-2细胞中过表达FOXO3，检测Keap1、Nrf2、HO-1表达及亚细胞定位变化，观察核转位。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物实验（芹菜素配制） | 芹菜素 | MCE, USA | -- |
| 动物实验（模型建立） | 乙醛酸 | -- | -- |
| 药物处理 | MK-2206 | MedChemExpress (MCE), USA | HY-108232 |
| N-乙酰半胱氨酸 | MCE | HY-B0215 | |
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco, USA | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 细胞培养（转染） | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen, USA | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| qRT-PCR | TransScript一步法去除基因组DNA及cDNA合成SuperMix | -- | -- |
| TransStart Green qPCR SuperMix | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| ECL检测试剂盒 | -- | -- | |
| 细胞培养和动物实验（MK-2206溶剂） | 磷酸盐缓冲液 | -- | -- |
| 细胞培养（细胞系） | HK-2细胞 | China Type Culture Collection Center (Wuhan) | -- |
| 细胞处理 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 细胞处理（COM晶体） | 氯化钙 | -- | -- |
| 草酸钠 | -- | -- | |
| 细胞处理（COM晶体制备） | 氯化钠 | -- | -- |
| 凋亡检测 | APC Annexin V凋亡检测试剂盒 | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- | |
| 凋亡检测（Annexin V染色） | Annexin V-FITC | -- | -- |
| 氧化应激检测 | ROS检测试剂盒 | Beyotime Biotechnology, China | S0033S |
| 线粒体ROS检测 | MitoSO Red | Beyotime Biotechnology, China | S0061S |
| 细胞周期分析 | RNase A | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 免疫荧光 | Nrf2抗体 | Proteintech | 16396-1-AP |
| FOXO3抗体 | Proteintech | 66428-1-Ig | |
| 免疫荧光/染色 | DAPI荧光染料 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、周龄：8周龄雄性C57BL/6J；造模剂及剂量：乙醛酸盐100 mg/kg/d腹腔注射；给药方案：第4天至第10天，每日一次 阅读提示：见Methods部分，Construction and administration method of calcium oxalate crystal kidney mouse model |
| 芹菜素给药 | 给药剂量：10、25、50 mg/kg/d；给药方式：口服灌胃，溶剂0.5% CMC-Na；给药时间：连续10天；给药前禁食4小时 阅读提示：见Methods部分，Construction and administration method of calcium oxalate crystal kidney mouse model |
| 细胞模型建立 | 细胞系：HK-2；培养基：DMEM/F12+10% FBS；COM处理浓度：2.0 nM；处理时间：24小时 阅读提示：见Methods部分，Cell culture and treatment |
| 药物预处理 | 芹菜素预处理浓度：100 μM，预处理时间：2小时；MK-2206浓度：10 μM，预处理时间：2小时；NAC浓度：4 mM，预处理时间：2小时 阅读提示：见Methods部分，Cell culture and treatment |
| 基因敲低和过表达 | si-AKT1序列：5'-CUUGGAUUUGUACCAUUCUUC-3'；转染试剂：Lipofectamine 3000；转染时间：mRNA检测24小时，蛋白检测48小时 阅读提示：见Methods部分，Cell transfection |