临床队列与样本收集
获取抗PD-1耐药黑色素瘤患者的肿瘤活检，并关联临床疗效。
从SWOG S1616试验的86名患者中收集基线和治疗中活检（治疗开始后28-35天），并收集归档活检样本。
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细胞邻域决定抗CTLA-4治疗原发性抗PD-1黑色素瘤中的抗肿瘤T细胞浸润
Cellular Neighborhoods Govern Antitumor T-cell Infiltration Following Anti-CTLA-4 in Melanoma with Primary Resistance to Anti-PD-1
实验完整度
高本研究整合临床试验活检样本的WES、RNA-seq、MIBI空间蛋白组学及CosMx和Visium空间转录组学，包含基因组、转录组和空间层面的功能验证。
主要模型
患者黑色素瘤活检组织（基线、治疗中及存档样本） SWOG S1616试验队列（联合治疗组与伊匹单抗单药组）
重点核对
治疗分组：联合治疗（伊匹单抗+纳武单抗）对比伊匹单抗单药 疗效评估：RECIST v1.1标准，CR/PR为响应，SD/PD为非响应 活检时间点：基线（治疗前）与治疗中（第28-35天，第二周期第一日） 检测平台：WES、RNA-seq、MIBI（32个蛋白标志物）、NanoString CosMx、10X Visium 数据分析方法：差异表达分析（DESeq2）、基因集富集分析（fgsea）、空间分析（SPOT）、网络分析（Louvain聚类）
摘要
在SWOG S1616（NCT03033576）二期试验中，对原发性抗PD-1/PD-L1治疗晚期黑色素瘤患者，联合使用抗CTLA-4抗体伊匹单抗与继续抗PD-1（纳武单抗）相比单用伊匹单抗，患者结局有所改善。对联合治疗有反应的患者基线活检显示，髓系细胞中补体、内皮细胞中干扰素通路以及黑色素瘤细胞中氧化磷酸化和脂质代谢的转录组表达增加。利用空间蛋白质组学，一些联合治疗反应患者的治疗中活检显示激活的CD8 T细胞网络邻近黑色素瘤细胞，而另一些则显示T细胞和髓系细胞，反映了动态抗肿瘤反应的不同时间点。相反，联合免疫治疗进展患者的活检显示，浆细胞邻近区域T细胞浸润受损。我们的结果定义了黑色素瘤活检中加入抗CTLA-4逆转抗PD-1耐药时的细胞邻域和转录组，以及无反应活检中的浆细胞片层。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在原发性抗PD-1黑色素瘤中，加入抗CTLA-4治疗（伊匹单抗）逆转耐药并产生临床反应的肿瘤微环境特征是什么？
- 核心机制
- 反应性活检中的抗肿瘤免疫反应涉及髓系细胞补体通路、内皮细胞干扰素通路和黑色素瘤细胞氧化磷酸化/脂质代谢，以及肿瘤内激活的CD8 T细胞网络；非反应性活检中，浆细胞片层（CD138+）与T细胞浸润受损和CXCL13表达相关。
- 主要证据
- 通过WES、RNA-seq、MIBI空间蛋白组学和空间转录组学分析患者活检，发现响应者基线活检富集特定基因集，治疗中活检显示肿瘤反应性CD8 T细胞网络（如LAG3+、颗粒酶B+）和肿瘤消退，而非响应者活检存在浆细胞片层，且其存在与进展显著相关（Fisher精确检验p=0.021）。
- 研究意义
- 本研究为抗PD-1耐药黑色素瘤患者加入抗CTLA-4治疗提供了细胞邻域和转录组层面的机制理解，并提示基线浆细胞片层可能作为预测联合免疫治疗无反应的潜在标志。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
基因组分析
评估肿瘤突变负荷、驱动基因突变和克隆动态与治疗反应的关系。
对活检样本进行全外显子测序（WES），分析TMB、UV突变特征、驱动基因突变和拷贝数改变，并比较响应与无响应患者的基因组特征。
转录组分析
识别与联合治疗反应相关的基因表达特征和通路。
对活检样本进行RNA测序，进行差异表达分析和基因集富集分析，并比较基线、治疗中及不同反应组间的表达差异。
空间蛋白组学分析（MIBI）
在组织原位分析肿瘤微环境中的细胞类型组成和细胞邻域关系。
使用MIBI对32个蛋白标志物进行多重成像，对细胞类型进行分段和聚类，并通过SPOT分析评估与治疗反应相关的细胞邻域。
空间转录组学分析
验证并细化特定细胞类型和微环境中的基因表达特征。
对代表性样本进行NanoString CosMx和10X Visium空间转录组学分析，评估细胞类型特异性基因表达和区域异质性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因组分析
转录组分析
空间蛋白组学分析
免疫组化分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 核酸提取 | Qiagen AllPrep DNA/RNA Mini试剂盒 | Qiagen | Catalogue #80284 |
| FFPE核酸提取 | Covaris truXTRAC FFPE tNA Ultra试剂盒 | Covaris | SKU#520252 |
| 核酸超声破碎 | Covaris M220超声破碎仪 | Covaris | RRID:SCR_027073 |
| Covaris E220 evolution聚焦超声破碎仪 | Covaris | RRID:SCR_019817 | |
| 文库构建 | Agilent SureSelect XT HS2 DNA文库制备试剂盒 | Agilent | Catalogue #G9984A |
| Agilent SureSelect XT HS2 RNA文库制备试剂盒 | Agilent | Catalogue #G9992C | |
| 测序平台 | Agilent BRAVO自动化液体处理平台 | Agilent | RRID:SCR_026137 |
| 空间转录组学 | 10X Genomics Visium FFPE空间基因表达平台 | 10X Genomics | RRID:SCR_023571 |
| 10X Genomics Space Ranger软件 | 10X Genomics | RRID:SCR_025848 | |
| NanoString CosMx空间分子成像仪 | NanoString | RRID:SCR_023909 | |
| AtoMx空间信息平台 | NanoString | v1.3 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者队列与样本收集 | 研究对象为高级别黑色素瘤且对PD-1/PD-L1治疗原发耐药；治疗分组包括联合治疗（伊匹单抗+纳武单抗）或伊匹单抗单药；活检时间点为基线和治疗第28-35天；样本类型为FFPE活检和血液。 阅读提示：见“Methods”中“Patient sample acquisition and clinical demographics”及各图注（Figure 1A）。 |
| 基因组分析（WES） | WES数据来自185个活检（78名患者），分析TMB、UV突变特征、驱动基因突变和拷贝数改变；代表性活检选择标准为最高肿瘤细胞纯度。 阅读提示：见“Results”中“Genomic features of response”及“Methods”中“WES and RNAseq analysis”。 |
| 转录组分析（RNA-seq） | RNA-seq数据来自107个活检（60名患者），比较基线响应（n=12）与无响应（n=25）的差异表达基因和基因集；使用DESeq2进行差异分析，fgsea进行基因集富集分析，GSVA进行单样本评分。 阅读提示：见“Results”中“Transcriptomic features of response”及“Methods”中“WES and RNAseq analysis”。 |
| 空间蛋白组学分析（MIBI） | MIBI分析使用32蛋白抗体panel，对基线（n=20）和治疗中（n=25）活检进行成像；ROI大小为800×800 μm，每个活检1-13个ROI；细胞类型分段和聚类作为核心环节。 阅读提示：见“Results”中“Spatial correlates of response to combination therapy”及“Methods”中“Multiplexed ion beam imaging analysis”。 |
| 空间转录组学分析（CosMx和Visium） | CosMx用于3个基线活检（PT0689、PT0613、PT0661），Visium用于1个基线活检（PT0765）；使用10X Genomics Visium FFPE v2平台，spot大小为50 μm，目标基因18,085个；CosMx使用Human RNA Universal Cell Characterization试剂盒。 阅读提示：见“Methods”中“Spatial transcriptomics by 10X Visium”和“Spatial transcriptomics by NanoString CosMx”。 |