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        母体代谢的胎儿操控是印记基因Igf2的关键功能

        Fetal manipulation of maternal metabolism is a critical function of the imprinted Igf2 gene

        作者信息Jorge Lopez-Tello, Hannah E J Yong, Ionel Sandovici, Georgina K C Dowsett, Efthimia R Christoforou, Esteban Salazar-Petres, Rebecca Boyland, Tina Napso, Giles S H Yeo, Brian Y H Lam, Miguel Constancia, Amanda N Sferruzzi-Perri
        PMID37437545
        期刊Cell Metab
        发布时间2023-07-11
        DOI10.1016/j.cmet.2023.06.007
        来源查看原文

        实验完整度

        高

        利用Cre-LoxP条件敲除小鼠模型，结合体内代谢测试、胎盘葡萄糖转运实验、蛋白组学、单核RNA测序及后代饮食干预等多层次实验。

        主要模型

        小鼠模型（C57BL/6J背景，TpbpaCre; Igf2flox） 胎盘内分泌细胞（交界区） 体外培养的胎盘内分泌细胞 后代小鼠（chow或HSHFD饮食）

        重点核对

        TpbpaCre介导的Igf2敲除仅限于胎盘交界区内分泌细胞； 孕鼠在GD16进行代谢表型分析； 胎儿和胎盘重量、血浆葡萄糖、胎盘葡萄糖清除率； 后代在12周龄进行ITT，13周龄进行DEXA和血脂分析； 饮食干预（标准饮食vs高糖高脂饮食）。

        摘要

        哺乳动物的母体-后代相互作用既涉及合作也涉及冲突。胎儿已经进化出操纵母体生理以增强胎盘营养转运的方式，但所涉及的机制仍不清楚。印记基因Igf2在小鼠胎盘内分泌细胞中高表达。在此，我们表明，在这些细胞中删除Igf2会损害胎盘向母体的内分泌信号，而不影响胎盘形态。Igf2控制胎盘激素的产生，包括促乳素，并且对于建立妊娠相关的胰岛素抵抗和将营养分配给胎儿至关重要。因此，缺乏胎盘内分泌Igf2的胎儿生长受限且低血糖。机制上，Igf2控制蛋白质合成和细胞能量稳态，这些作用依赖于胎盘内分泌细胞类型。Igf2缺失还对后代成年期的代谢产生额外的长期影响。我们的研究为胎盘中运作的内在胎儿操控系统提供了令人信服的证据，该系统改变母体代谢和胎儿资源分配，并对后代代谢健康产生长期影响。

        实验结论

        提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。

        研究问题
        胎盘内分泌细胞中的印记基因Igf2是否通过调控母体代谢来影响胎儿生长和后代代谢健康？
        核心机制
        Igf2通过调节胎盘内分泌细胞的蛋白质合成和能量稳态，控制胎盘激素（如促乳素）的分泌，进而建立母体胰岛素抵抗和促进营养物质向胎儿转运。
        主要证据
        小鼠条件敲除模型显示，Igf2缺失导致胎儿生长受限和低血糖，母体胰岛素敏感性增加，循环促乳素和kallistatin减少；体外培养和snRNA-seq显示多种促乳素基因下调。
        研究意义
        研究首次提供了胎盘印记基因作为胎儿操控母体代谢系统的实验证据，揭示了其对后代成年代谢健康的长期影响，对理解妊娠并发症和后代代谢疾病具有重要意义。

        研究路径

        按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

        1

        建立条件性敲除小鼠模型

        在胎盘内分泌细胞中特异性地删除Igf2，以研究其对母体代谢和胎儿生长的影响。

        利用TpbpaCre和Igf2flox小鼠进行正反交，产生UE（父源删除）和对照（母源删除）窝，在GD16进行分析。

        2

        表型分析：胎儿和胎盘结局

        评估Igf2缺失对胎儿生长、胎盘形态和葡萄糖转运的影响。

        测量胎儿体重、胎盘重量、交界区体积和细胞组成，进行葡萄糖耐量和胰岛素耐量测试，以及放射性标记葡萄糖的胎盘转运实验。

        3

        母体代谢表型分析

        检测Igf2缺失对母体葡萄糖代谢、胰岛素敏感性、脂质代谢和激素水平的影响。

        对孕鼠进行GTT和ITT，测量循环胆固醇、甘油三酯、游离脂肪酸、胰岛素、雌二醇和孕酮水平，以及胰腺β细胞质量和肝脏蛋白表达。

        4

        分子机制分析

        阐明Igf2缺失导致母体代谢异常的分子机制，特别是胎盘内分泌功能的变化。

        进行母体血浆蛋白组学（LC-MS/MS），胎盘内分泌细胞的单核RNA测序（snRNA-seq），体外细胞培养和条件培养基的蛋白组学分析，以及信号通路蛋白的免疫印迹。

        5

        后代代谢健康评估

        研究宫内Igf2缺失对后代成年期代谢健康的影响，尤其是在饮食挑战下。

        在标准饮食或高糖高脂饮食（HSHFD）下饲养后代，于成年期进行胰岛素耐量、身体组成、血脂、肝功能和肝脏蛋白分析。

        研究方法

        按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。

        模型构建
        Cre-LoxP条件性敲除PCR基因分型
        表型分析
        免疫组织化学体视学血糖测量胎盘葡萄糖转运实验
        代谢评估
        葡萄糖耐量试验胰岛素耐量试验双能X射线吸收法
        分子和组学分析
        实时荧光定量PCR蛋白质印迹法液相色谱-串联质谱法单核RNA测序酶联免疫吸附测定

        产品清单

        实验环节名称品牌货号
        抗体胰岛素抗体Cell SignalingRRID:AB_659820
        胰岛素受体β抗体Cell SignalingRRID:AB_2249166
        PI3K-p85α抗体MilliporeRRID:AB_310069
        磷酸化Akt(Ser473)抗体Cell SignalingRRID:AB_2315049
        AKT抗体Cell SignalingRRID:AB_329827
        GβL(86B8)抗体Cell SignalingRRID:AB_823685
        PEPCK抗体Santa CruzRRID:AB_10610383
        脂蛋白脂肪酶抗体AbcamRRID:AB_446221
        PPARα抗体AbcamRRID:AB_303844
        PPARγ抗体Santa CruzRRID:AB_628115
        磷酸化AMPK(Thr172)抗体Cell SignalingRRID:AB_331250
        AMPK抗体Cell SignalingRRID:AB_10624867
        STAT3抗体MilliporeRRID:AB_10807169
        STAT5抗体Cell SignalingRRID:AB_2798908
        S6核糖体蛋白抗体Cell SignalingRRID:AB_2146239
        IGF-II受体抗体Cell SignalingRRID:AB_2753208
        IGF-I受体抗体Cell SignalingRRID:AB_10950969
        IGF-II抗体R&D SystemsRRID:AB_354449
        Alexa Fluor 488抗体Jackson ImmunoResearchRRID:AB_2340430
        羊抗小鼠IgGGE HealthcareRRID:AB_772210
        驴抗兔IgGGE HealthcareRRID:AB_772206
        山羊抗兔IgGAbcamRRID:AB_954902
        生化试剂RIPA裂解液SigmaR0278
        链霉亲和素偶联过氧化物酶Rockland ImmunochemicalsS000-03
        核固红Vector LaboratoriesH-3403
        DAPISigmaD9542
        RNA提取RNeasy Plus 小型试剂盒Qiagen74134
        RNeasy 纤维组织小型试剂盒Qiagen74704
        RNeasy 脂质组织小型试剂盒Qiagen74804
        cDNA合成RevertAid RT 逆转录试剂盒Thermo Fisher ScientificK1622
        qPCRSYBR Green JumpStart Taq 预混液SigmaS4438
        放射性检测Biosol组织溶解液National diagnosticsLS-310
        细胞培养NTCT-135培养基Thermo Fisher Scientific41350026
        蛋白定量Pierce BCA蛋白定量试剂盒Thermo Fisher Scientific23225
        Western blot硝酸纤维素膜Biorad1620115
        SuperSignal West Femto底物Thermo Fisher Scientific34094
        丽春红S染色液Thermo Fisher ScientificA40000279
        细胞核分离OptiPrep密度梯度介质SigmaD1556
        单核RNA测序Chromium NEXT GEM单细胞3' GEM、文库和凝胶磁珠试剂盒10X Genomics1000128
        Chromium Next GEM Chip G单细胞试剂盒10X Genomics1000127
        胎盘葡萄糖转运3H-甲基-D-葡萄糖Perkin-ElmerNEN NEC-377
        生化检测胰岛素检测试剂盒MercodiaRRID:AB_2783837
        激素检测雌二醇检测试剂盒Cayman Chemical582251
        孕酮检测试剂盒Cayman Chemical582601
        IGF-II检测试剂盒R&D SystemsRRID:AB_2884002
        生化检测游离脂肪酸检测试剂盒Roche11383175001
        甘油三酯检测试剂盒Siemens HealthcareDF69A
        胆固醇检测试剂盒Siemens HealthcareDF27
        丙氨酸氨基转移酶检测试剂盒Siemens HealthcareDF143
        丙氨酸转氨酶检测试剂盒Siemens HealthcareDF41A
        动物模型Igf2fl/fl小鼠----
        TpbpaCre小鼠----
        Rosa26mT/mG小鼠--RRID:IMSR_JAX:007676
        引物合成用于基因分型或定量PCR的引物Sigma Aldrich (Merck)--
        饮食SDS大鼠和小鼠3号繁殖饲料SDS--
        含45%千卡脂肪的啮齿动物饲料Research DietsD12451
        矿物质混合物MP BiomedicalsAIN93G

        关键环节

        汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

        环节核对要点
        动物模型构建
        TpbpaCre和Igf2flox小鼠的遗传背景（C57BL/6J），交配策略（雌性TpbpaCre纯合与雄性Igf2flox纯合，或相反），基因分型方法。
        阅读提示：参见Materials and Methods中的Mice and genotyping
        胎盘内分泌细胞Igf2敲除确认
        通过免疫荧光和qPCR验证Jz中IGF2蛋白和mRNA的减少。
        阅读提示：参见Results部分和图1C、S1E-F
        母体代谢表型分析
        在GD16进行GTT和ITT的禁食时间（6小时）、葡萄糖注射剂量（1g/kg）、胰岛素注射剂量（0.75 units/kg）。
        阅读提示：参见Materials and Methods中的Glucose and insulin tolerance tests
        胎儿葡萄糖转运实验
        放射性示踪剂3H-甲基-D-葡萄糖的注射方式（静脉注射）、剂量、检测时间，以及母体-胎儿清除率的计算。
        阅读提示：参见Materials and Methods中的Placental glucose transport assay
        后代代谢健康评估
        后代断奶后饮食（标准chow或45%高脂加20%蔗糖饮水），ITT在12周龄，DEXA在13周龄，血液生化和肝功能指标。
        阅读提示：参见Materials and Methods中的Diets和Offspring studies部分

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