iRECs分化与纯化
从hiPSCs分化出视网膜特异性内皮细胞。
使用ETV2 mRNA电穿孔进行中胚层诱导，然后在含Norrin、vitronectin（及后续RepSox）的培养基中分化，并通过CD31和Fz4双阳性分选纯化iRECs。
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从人多能干细胞衍生功能性视网膜内皮细胞用于治疗和建模
Derivation of functional retinal endothelial cells from human pluripotent stem cells for therapeutics and modelling
实验完整度
高包含多种独立验证：体外细胞分化与功能验证（TEER、通透性、转运体活性）、2D/3D疾病模型（高糖+缺氧）、体内OIR小鼠模型、转录组分析（RNA-Seq）、微生理芯片共培养。
主要模型
人诱导多能干细胞（WTC-TJP1和C1-2）分化iRECs及iECs 原代人视网膜内皮细胞（HRECs） 氧诱导视网膜病变（OIR）小鼠模型 iRECs三维胶原蛋白水凝胶血管网络及iBRB-on-a-chip微生理系统
重点核对
分化方案：添加Norrin、vitronectin及RepSox以诱导和成熟视网膜内皮细胞 DR条件：30 mM D-葡萄糖联合1% O2处理 体内注射剂量：iRECs以50,000 cells/μl溶于PBS进行玻璃体腔注射 OIR模型时间点：P12注射，P17分析 RNA-Seq分析：4个生物学重复
摘要
视网膜微血管疾病涉及受损的内血-视网膜屏障（iBRB），其机制仍知之甚少。因此，可再生的人iBRB内皮来源对于推进眼科研究和治疗开发至关重要。在此，我们通过Wnt–β-catenin通路（即Norrin–Frizzled4信号）将人诱导多能干细胞分化为视网膜内皮细胞（iRECs）。这些iRECs表现出遗传、蛋白质和功能保真度以及独特的视网膜特征。当注射到氧诱导视网膜病变小鼠中时，iRECs整合到宿主血管网络中，并使缺血眼重新血管化，拯救了组织。在微生理模型中，iRECs形成可灌注的微血管网络，在健康和糖尿病状态下重现iBRB形态和表型，同时与诱导多能干细胞来源的视网膜周细胞进行生理性组织和相互作用。我们的研究建立了功能性人iRECs和微生理iBRB模型，有助于机制研究，以识别治疗靶点并促进受损视网膜的再血管化，从而支持治疗进展。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何从人诱导多能干细胞获得具有功能性和视网膜特异性的视网膜内皮细胞（iRECs），并验证其在疾病建模和治疗中的应用潜力？
- 核心机制
- 通过激活Wnt–β-catenin信号通路，特别是Norrin–Frizzled4轴，以及添加vitronectin和RepSox，可诱导hiPSCs分化为具有视网膜表型和功能的iRECs。
- 主要证据
- iRECs表达视网膜特异性标记物（如Fz4、Claudin-2），具有高TEER和功能性GLUT1/p-gp转运活性；在DR条件下重现屏障破坏和血管网络异常；在OIR小鼠中整合宿主血管网络并减少无血管区和新生血管；转录组分析显示与HRECs相似的视网膜特征。
- 研究意义
- 研究建立了功能性人iRECs和微生理iBRB模型，有助于机制研究以识别治疗靶点并促进受损视网膜的再血管化，为视网膜微血管疾病治疗提供新策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
iRECs功能与屏障特性验证
验证iRECs是否具有视网膜内皮细胞的高屏障功能和转运功能。
通过TEER测量、通透性实验、GLUT1葡萄糖摄取和p-gp外排功能评估iRECs的功能特性，并与iECs比较。
健康与糖尿病状态下2D/3D疾病建模
评估iRECs在正常和糖尿病视网膜病变（DR）条件下的反应。
将iRECs暴露于高糖和低氧环境（30 mM D-葡萄糖+1% O2），分析屏障蛋白定位、TEER变化、血管网络形态变化。
转录组分析
阐明iRECs的转录组特征及其与视网膜内皮细胞的相似性。
对iRECs和iECs进行RNA-Seq，分析差异表达基因、GO富集、Wnt信号通路网络，并与HRECs和iPSC-脑EC数据比较。
体内治疗效果验证
验证iRECs在缺血性视网膜中的治疗潜力。
在OIR小鼠模型中，P12玻璃体腔注射iRECs，P17评估无血管区（VO）、新生血管（NV）、血管整合及渗透性。
构建iBRB-on-a-chip模型
建立具有内皮-周细胞相互作用的功能性iBRB微生理系统。
利用微流控芯片，将iRECs在胶原I水凝胶中培养形成网络，并加入iRPCs共培养，评估血管网络形态、通透性及细胞相互作用。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
3D血管网络建模
细胞迁移分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养与分化 | mTeSR1培养基 | STEMCELL Technologies | -- |
| Essential 6培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Essential 8培养基 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 分化诱导 | CHIR99021 | STEMCELL Technologies | -- |
| 转染 | ETV2修饰mRNA | TriLink Biotechnologies | -- |
| Opti-MEM | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Gene Pulser Xcell电穿孔系统 | Bio-Rad | -- | |
| 细胞培养 | Matrigel | Corning | -- |
| 玻璃粘连蛋白 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| I型胶原蛋白 | Corning | -- | |
| IV型胶原蛋白 | -- | -- | |
| 分化培养基 | 内皮细胞生长培养基 | Promocell | -- |
| SB-431542 | Cayman Chemical Company | -- | |
| VEGF-A | PeproTech | -- | |
| FGF-2/bFGF | PeproTech | -- | |
| Y-27632 | Selleckchem | -- | |
| Norrin（人Norrin重组蛋白） | Boster Bio | -- | |
| RepSox | Selleckchem | -- | |
| 细胞培养 | 人乏血小板血清 | Millipore Sigma | -- |
| MACS缓冲液 | -- | -- | |
| 细胞分选 | PE偶联抗人CD31抗体 | BD Biosciences | -- |
| 抗PE微磁珠 | Miltenyi Biotec | -- | |
| MS MACS分离柱 | Miltenyi Biotec | -- | |
| PE偶联抗人Fz4抗体 | Miltenyi Biotec | -- | |
| 细胞培养 | 周细胞培养基 | ScienCell | -- |
| Complete Classic培养基 | Cell Systems | -- | |
| 流式分析 | BD FACSCanto流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 可固定活力染料eFluor 780 | Invitrogen | -- | |
| 蛋白提取 | RIPA缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 蛋白定量 | Pierce BCA蛋白分析试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Western blot | Mini-PROTEAN TGX预制胶 | Bio-Rad | -- |
| Clarity Western ECL底物 | Bio-Rad | -- | |
| ChemiDoc成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RNA纯化 | RNeasy mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| RNA定量 | NanoDrop分光光度计 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| RT-qPCR | GoScript逆转录随机引物试剂盒 | Promega | -- |
| TaqMan通用PCR预混液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| QuantStudio 3 PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| SYBR Green引物 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| DR处理 | D-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | -- |
| 低氧处理 | BioSpherix低氧培养箱 | BioSpherix | -- |
| TEER测量 | EVOM3电阻仪 | World Precision Instruments | -- |
| STX-4电极 | World Precision Instruments | -- | |
| 通透性实验 | 70 kDa FITC-葡聚糖 | Millipore Sigma | -- |
| HBSS缓冲液 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 酶标仪（BioTek Synergy H1） | Agilent | -- | |
| GLUT1摄取实验 | 葡萄糖摄取Glo检测试剂盒 | Promega | J1341 |
| Bay-876 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 2-脱氧葡萄糖 | -- | -- | |
| p-gp实验 | Tariquidar | MedchemExpress | -- |
| 罗丹明123 | Cayman | -- | |
| Halt蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 细胞刮刀 | CELLTREAT | -- | |
| 细胞因子刺激 | 重组人TNF | STEMCELL Technologies | -- |
| LDL摄取实验 | Dil-乙酰化低密度脂蛋白 | Invitrogen | -- |
| 3D网络形成 | Medium 199培养基（1×） | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Medium 199培养基（10×） | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 大鼠尾I型胶原蛋白 | Corning | -- | |
| 细胞透化 | Triton X-100 | Sigma-Aldrich | -- |
| 封闭 | 牛血清白蛋白 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 核染色 | DAPI | -- | -- |
| 荧光成像 | Nikon AX-R共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| 图像分析 | Fiji | -- | -- |
| Imaris | -- | -- | |
| NIS-Elements AR | Nikon | -- | |
| FlowJo | -- | -- | |
| GraphPad Prism | -- | -- | |
| JMP | -- | -- | |
| 微流控芯片制作 | 聚二甲基硅氧烷 | -- | -- |
| Harrick Plasma等离子体清洗机 | Harrick Plasma | -- | |
| 多聚-L-赖氨酸 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 中和液 | Advanced Biomatrix | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 体内通透性实验 | 70 kDa罗丹明葡聚糖 | -- | -- |
| 视网膜染色 | DyLight 649偶联的Griffonia simplicifolia凝集素I异凝集素B4 | Vector Laboratories | -- |
| 罗丹明偶联的UEA1 | Vector Laboratories | -- | |
| 封片 | Fluoromount-G封片剂 | Invitrogen | -- |
| 迁移实验 | PDGFBB | PeproTech | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| iRECs分化与纯化 | 分化起始细胞系（WTC-TJP1或C1-2）、种子密度、CHIR99021浓度和处理时间、ETV2 mRNA量、电穿孔参数、Norrin和vitronectin浓度、纯化时机和分选策略 阅读提示：Methods: Maintenance and differentiation of hiPSCs; Purification and expansion of iECs, iRECs and iRPCs |
| DR体外处理 | D-葡萄糖浓度（30 mM）、低氧浓度（1% O2）、处理时间（2D中24h，TEER中72h）、培养基成分（ECGM+RepSox+血小板贫乏人血清） 阅读提示：Methods: Diabetic retinopathy treatment |
| 3D胶原蛋白水凝胶血管网络形成 | 细胞密度（800,000 cells/ml）、胶原I浓度（7.1 mg/ml）、凝胶pH（7.0-7.5）、孵育时间（3天）、培养基（ECGM+50 ng/ml VEGF-A） 阅读提示：Methods: Formation of 3D collagen hydrogel vascular networks |
| OIR小鼠模型 | 小鼠品系（C57BL/6J）、氧浓度（75%）、暴露时间（P7-P12）、注射时间（P12）、注射细胞剂量（50,000 cells/μl）、分析时间（P17） 阅读提示：Methods: Oxygen-induced retinopathy mouse model and intravitreal injection; Retina flat mount and immunofluorescence staining |
| iBRB-on-a-chip | 微流控芯片通道尺寸（800 μm × 1,300 μm × 250 μm 或 2,800 μm × 4,500 μm × 500 μm）、胶原I浓度、细胞密度（340,000 iRECs/gel）、iRPC比例（15:1）、培养时间（3-5天）、渗透性实验方法（70 kDa rhodamine dextran） 阅读提示：Methods: Fabrication of microfluidic device and iBRB-on-a-chip network formation; iBRB-on-a-chip permeability assay |