MPXV分支IIb基因组BAC克隆
获得完整MPXV基因组的可操作克隆，以便在细菌中进行遗传修饰。
利用STAR克隆方法，在BSL-3条件下感染MA-104细胞并收获HMW DNA，经Cas9切割后与线性化载体（含BAC和酵母着丝粒序列、同源臂和eGFP报告基因）共转化酵母，随后转移至E. coli，通过限制性酶切和测序验证克隆完整性。
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猴痘病毒分支IIb基因组的分子克隆及用于基础与转化研究的减毒突变体的构建
Molecular cloning of a monkeypox virus clade IIb genome and construction of an attenuated mutant for basic and translational research
实验完整度
高包含体外细胞培养复制动力学、CAST/EiJ小鼠体内感染模型、器官病毒载量及T细胞免疫应答（ELISpot）等多个独立证据层级，且包含功能验证（复制、毒力）与机制关联（TK基因功能）。
主要模型
MA-104细胞 Vero细胞 HaCaT细胞 CAST/EiJ小鼠皮内感染模型
重点核对
MPXV分支IIb分离株MPXV-BY-IMB25241作为病毒亲本，BAC克隆中载体插入位点（OPG084和OPG085之间）及loxP位点介导的载体切除 TK基因（OPG101）缺失：400 bp（75% ORF），保留3'端25%以避免影响下游OPG102表达 病毒感染剂量：2×10^5 PFU/鼠，经尾皮划痕途径接种 动物模型：CAST/EiJ小鼠，感染后12天或8天观察体重、临床评分和皮肤病变，并在第8天检测器官病毒滴度 人血清中和实验和抗病毒药物测试（brincidofovir和acyclovir）的应用
摘要
猴痘病毒（MPXV）是一种啮齿动物携带的正痘病毒，经人畜共患传播至人类后引起猴痘（mpox）疾病。最近的全球疫情提高了人们的认识，并强调了对基础与转化研究的需求。然而，研究因MPXV被归类为风险3级病原体而受到阻碍。为克服这一限制，我们通过酵母中单步转化相关重组（STAR）克隆方法生成了一个完整的全长MPXV分支IIb细菌人工染色体（BAC）克隆。验证了克隆的MPXV基因组序列的完整性和BAC来源病毒的复制能力。为获得减毒突变体，通过BAC重组工程删除了病毒胸苷激酶（TK）基因OPG101。TK缺陷型MPXV突变体在细胞培养中的复制滴度与野生型病毒相似，但在体内减弱，如CAST/EiJ小鼠皮内感染模型所示。减毒的TK缺陷型MPXV突变体有潜力被监管机构归类为风险2级病原体。这将允许在生物安全2级实验室进行研究，并极大地促进基础和应用MPXV研究。例如，我们证明TK缺陷型病毒可用于检测人血清样本中的中和抗体或用于抗病毒药物测试。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何克服MPXV作为风险3级病原体对研究的限制，并建立可用于基础与转化研究的MPXV基因组克隆及减毒病毒平台？
- 核心机制
- 删除胸苷激酶（TK）基因OPG101降低了病毒在体内（尤其非分裂细胞）的核苷酸补救途径能力，导致病毒在体内复制和播散减少，从而减弱毒力，但在分裂活跃的细胞中复制不受明显影响。
- 主要证据
- STAR克隆获得完整MPXV分支IIb BAC；TK缺失突变体在MA-104、Vero和HaCaT细胞中复制动力学与野生型相似；在CAST/EiJ小鼠尾皮划痕感染模型中，TK突变体体重减轻和临床评分降低，无尾部皮肤病变，器官（肝、肺）中病毒滴度显著降低；IFN-γ ELISpot显示T细胞免疫应答相似。
- 研究意义
- 提供一个完全测序验证的MPXV分支IIb BAC克隆和减毒TK缺失突变体，该突变体可能被重新分类为风险2级病原体，从而允许在BSL-2实验室进行研究，促进病毒生物学、诊断学、治疗学和载体应用的研究，并可应用于中和抗体的检测和抗病毒药物筛选。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
BAC遗传修饰：TK基因缺失
构建减毒突变体，为研究提供致病性降低的病毒工具。
通过en passant BAC重组工程在E. coli中删除OPG101基因（TK）的400 bp序列（75% ORF），并验证缺失和序列正确性。
病毒拯救和细胞培养中复制动力学
确认BAC克隆和TK缺失不影响病毒在培养细胞中的复制能力。
使用FPXV辅助病毒拯救病毒，然后比较WT和TK缺失病毒在MA-104、Vero和HaCaT细胞中的多步复制动力学，并进一步评估载体切除前后的复制情况。
体内致病性评估：CAST/EiJ小鼠模型
评估TK缺失突变体相对于野生型病毒在体内的减毒程度和疾病进程差异。
通过尾皮划痕感染CAST/EiJ小鼠，监测体重、临床症状和尾部皮肤病变，并在感染后第8天分析器官病毒滴度和病毒基因组拷贝，以及第12天分析T细胞免疫应答。
应用验证：中和抗体检测和抗病毒药物敏感性
证明减毒病毒可用于诊断中和抗体检测和抗病毒药物筛选。
利用WT和TK缺失病毒进行噬斑减少中和试验（PRNT50）检测人血清样本中的中和抗体，并进行噬斑减少试验评估药物敏感性（brincidofovir和acyclovir）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Sigma | -- |
| MEM培养基 | Sigma | -- | |
| 胎牛血清 | Capricorn | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| L-谷氨酰胺 | -- | -- | |
| 基因组编辑 | Cas9核酸酶 | IDT | -- |
| 质粒构建 | pCC1BAC-his3载体 | -- | -- |
| pEPkan-S质粒 | Addgene | 41017 | |
| pLIX-402慢病毒载体 | Addgene | 41394 | |
| DNA提取 | NucleoBond Xtra Midi试剂盒 | Macherey-Nagel | -- |
| NucleoMag组织试剂盒 | Machery-Nagel | -- | |
| 转染 | X-tremeGENE HP DNA转染试剂 | Sigma | -- |
| 病毒拯救 | 鸡痘病毒（辅助病毒） | -- | -- |
| 动物实验 | CAST/EiJ小鼠 | Jackson Laboratories | -- |
| 免疫检测 | 泛痘病毒肽池 | JPT Peptide Technologies | -- |
| 小鼠IFN-γ ELISpot试剂盒 | Mabtech | -- | |
| ELISpot分析 | ELISpot读板仪 | Cellular Technology Ltd. | -- |
| 免疫检测 | VACV（Lister株）兔多克隆抗体 | OriGene | -- |
| HRP标记的山羊抗兔抗体 | Biozol | -- | |
| TrueBlue过氧化物酶底物 | SeraCare | -- | |
| qPCR | Luna通用探针qPCR预混液 | New England Biolabs | -- |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | -- | |
| 测序 | NextSeq2000测序平台 | Illumina | -- |
| 纳米孔长读长测序 | Eurofins | -- | |
| 抗病毒药物测试 | 布林西多福韦 | MedChemExpress | -- |
| 阿昔洛韦 | MedChemExpress | -- | |
| 动物组织匀浆 | TissueLyser-II组织匀浆器 | Qiagen | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| STAR克隆 | HMW DNA来源（MPXV感染的MA-104细胞） 阅读提示：Materials and Methods, STAR cloning of the MPXV genome |
| BAC修饰 | E. coli菌株GS1783，en passant mutagenesis方法 阅读提示：Materials and Methods, BAC recombineering |
| 病毒拯救 | MA-104细胞，FPXV辅助病毒（MOI 0.05），X-tremeGENE HP转染试剂，BAC DNA用量 阅读提示：Materials and Methods, Virus reconstitution and vector excision |
| 细胞培养复制动力学 | MOI=0.05，感染时间点，细胞类型（MA-104、Vero、HaCaT） 阅读提示：Materials and Methods, Replication kinetics |
| 动物感染 | CAST/EiJ小鼠，尾皮划痕接种，病毒剂量2×10^5 PFU，PBS对照，感染后12天或8天观察 阅读提示：Materials and Methods, Infection of mice |
| 器官病毒载量检测 | 器官采样（尾皮肤、肝、脾、肺），组织匀浆，噬斑测定方法 阅读提示：Materials and Methods, Infection of mice |
| 中和试验 | 人血清样本来源（感染、接种MVA、阴性对照），血清稀释，补体（6%兔补体），病毒量200 PFU 阅读提示：Materials and Methods, Neutralization assay |
| 抗病毒药物敏感性试验 | 药物浓度范围，MOI=100 PFU/孔，MA-104细胞，48小时处理 阅读提示：Materials and Methods, Plaque reduction assay |