多中心队列构建与样本收集
建立用于发现和验证的血浆样本队列，评估循环分子特征的诊断价值。
从多中心前瞻性研究（NCT06016790）和独立外部中心纳入662名女性参与者（501+161），包括良性对照和乳腺癌患者（早期占79.5%），按照标准方案收集空腹外周血并分离血浆。
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血浆蛋白质组-代谢组特征实现乳腺癌的无创早期检测和淋巴结风险分层
Plasma proteome-metabolome signatures enable non-invasive early detection and lymph node risk stratification in breast cancer
实验完整度
高包含多中心前瞻性队列（发现队列、两个独立验证队列），采用DIA蛋白质组学、非靶向代谢组学、PRM靶向蛋白质组学、定量代谢组学，并构建机器学习模型进行内部和外部验证，证据层级多样，包含功能验证和机制关联分析。
主要模型
乳腺癌患者血浆样本 良性乳腺疾病对照血浆样本 多中心前瞻性队列（NCT06016790） 独立外部队列（长海医院、朝晖社区服务中心）
重点核对
样本采集：空腹、EDTA抗凝管，离心条件（1,600×g, 16,000×g，各10分钟，4℃） 蛋白质组定量：DIA模式，Orbitrap Astral质谱仪，扫描范围380-980 m/z，HCD碰撞能量25 eV 代谢组定量：Q Exactive HF质谱仪，BEH C18柱，正负离子模式，Full scan/ddMS2 模型构建：SEM堆叠集成，训练集/测试集70/30划分，SVM-RFE特征选择 验证：外部独立队列（n=161），AUC 0.951（ProMeta-BC）
摘要
尽管超声和钼靶检查广泛使用，但早期乳腺癌检测的准确性仍然不够理想，尤其是在乳腺组织致密的亚洲女性中，这凸显了对基于生物学信息的无创诊断方法的未满足需求。值得注意的是，对早期乳腺癌循环蛋白质组和代谢组改变的系统性表征仍然有限，尤其是在大型、经过充分验证的队列中。在此，我们利用一项注册的多中心前瞻性研究（NCT06016790）以及一个独立的外部验证队列，纳入了来自九家医疗机构的662名参与者，以评估基于血浆的多组学液体活检框架用于无创检测。数据非依赖采集蛋白质组学和非靶向代谢组学分析了5549种蛋白质和630种代谢物，并在独立队列中进行了靶向验证。整合分析揭示了协调的分子重塑，其特征是细胞骨架和黏附相关蛋白（如ACTN1、VCL、ITGA2B和MYH9）的富集，以及脂质代谢通路的重新布线。网络和轨迹建模进一步确定了13个恶性肿瘤相关蛋白模块和两条与进展相关的代谢轨迹。基于这些特征，我们开发了ProMeta-BC，一个整合血浆蛋白质组-代谢组的模型，包含15种蛋白质和5种代谢物，在训练和验证队列中分别实现了良恶性病变的稳健区分（AUC分别为0.973和0.951），以及ProMeta-BC-LN用于预测腋窝淋巴结转移（AUC分别为0.841和0.753）。值得注意的是，在影像学与病理学发现不一致的病例中，该模型检测出9例影像学阴性癌症中的8例，并正确重新分类了56例淋巴结判定不一致患者中的38例，表明了互补的临床效用。总之，这些发现表明，循环蛋白质组-代谢组中编码的协调分子特征捕获了疾病相关的生物学信息，并为乳腺癌的无创检测和分层提供了一个可扩展、可解释的框架。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 循环蛋白质组和代谢组特征能否实现乳腺癌的无创早期检测和淋巴结风险分层？
- 核心机制
- 早期乳腺癌伴随系统性分子重塑，包括细胞骨架和黏附相关蛋白（如ACTN1、VCL、ITGA2B、MYH9）富集，以及脂质代谢通路（如脂肪酸代谢）重新布线，这些协调变化可在外周血中检测到，并构成恶性肿瘤相关模块和代谢轨迹。
- 主要证据
- 基于多中心前瞻性队列（n=662），发现队列中DIA蛋白质组学和非靶向代谢组学分析，在验证队列中用PRM和定量代谢组学验证，并通过WGCNA共表达网络、mFuzz轨迹聚类和机器学习模型（ProMeta-BC）证明这些特征能有效区分良恶性（AUC 0.973/0.951）和预测淋巴结转移（AUC 0.841/0.753）。
- 研究意义
- 为乳腺癌提供了一种可扩展、可解释的无创检测与分层框架，为亚洲女性提供了人群特异性的分子参考，并增进了对全身性肿瘤-宿主相互作用的理解，可能有助于精准诊断和早期干预。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
发现阶段：非靶向蛋白质组学和代谢组学分析
描绘早期乳腺癌循环蛋白质和代谢物的整体分子图谱，识别候选差异分子。
对发现队列样本进行DIA蛋白质组学和UHPLC-MS/MS非靶向代谢组学分析，定量5549个蛋白质和630个代谢物，并比较良恶性样本差异。
靶向验证蛋白质和代谢物候选panel
在更大独立队列中验证候选分子的稳定性和诊断价值。
对Cohort 2（n=351）样本进行靶向PRM蛋白质组学（312个蛋白质）和定量代谢组学（170个代谢物）分析，确认差异表达的蛋白质和代谢物。
网络与轨迹分析揭示模块和动态变化
识别共表达模块和随疾病进展的动态变化，揭示潜在机制。
对靶向蛋白质组数据进行WGCNA分析（13个模块），对代谢物进行mFuzz聚类（10个轨迹），并进行交叉组学关联分析。
机器学习模型构建与验证
开发并验证基于多组学特征的诊断和淋巴结预测模型。
基于Cohort 2筛选的特征，分别构建ProMeta-BC（15蛋白+5代谢物）和ProMeta-BC-LN（6特征）模型，使用SEM堆叠集成，在内部测试集和独立外部验证集（Cohort 3）评估性能。
临床效用评估
评估模型在影像学阴性或影像-病理不一致病例中的补充价值。
在影像良性（BI-RADS 3）患者（n=9）和淋巴结影像-病理不一致病例中评估ProMeta-BC和ProMeta-BC-LN的性能。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 样本采集 | cfDNA采血管 | Ardent BioMed | BY10240301 |
| 蛋白质组学样本前处理 | Proteonano™血浆蛋白质组富集试剂盒 | Nanomics | -- |
| Nanomation™ G1基础自动化平台 | Nanomics | -- | |
| 蛋白质组学LC-MS/MS分析 | Vanquish Neo超高效液相色谱 | Thermo Scientific | -- |
| Orbitrap Astral质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 高通量µPAC™ Neo高效液相色谱柱 | -- | -- | |
| 代谢组学分析 | Waters BEH C18色谱柱 | Waters | -- |
| Vanquish Flex超高效液相色谱 | Thermo Scientific | -- | |
| Q Exactive HF质谱仪 | Thermo Scientific | -- | |
| 蛋白质组学数据处理 | Skyline v22.2软件 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集与处理 | 禁食状态，采血管类型，离心条件（1,600×g和16,000×g，10分钟,4℃），血浆储存温度（-80℃） 阅读提示：Methods: 样本采集和血浆蛋白质组学/代谢组学 |
| 蛋白质组学（DIA发现） | 色谱柱尺寸（5.5 cm）、流速（2 µL/min）、梯度（24 min，4%-35% B）、扫描范围（380-980 m/z）、分辨率（240,000）、HCD能量（25 eV） 阅读提示：Methods: 样本采集和血浆蛋白质组学，LC-MS/MS分析 |
| 蛋白质组学（PRM靶向） | 靶向蛋白列表（312个蛋白）、肽段筛选标准（长度6-30 aa,无漏切）、QC样本频率、缺失值阈值（>20%排除）、FDR控制 阅读提示：Methods: 样本采集和血浆蛋白质组学，靶向PRM分析 |
| 代谢组学（非靶向） | 进样量（5 µL）、QC样本频率（每10个样本）、色谱梯度、MS参数（分辨率60,000，扫描范围60-900 m/z） 阅读提示：Methods: 样本采集和血浆代谢组学 |
| 机器学习模型构建 | 训练/测试集划分（70/30，分层）、特征选择方法（SVM-RFE或LASSO+RFE）、基础学习器（GLM, SVM, GBM, MLP）、交叉验证策略（5折，10次重复）、群体水平分析（WGCNA等）仅在训练集内执行 阅读提示：Methods: 机器学习模型构建和验证 |
| 验证队列 | 外部验证队列（Cohort 3）样本来源（长海医院和朝晖社区服务中心）、是否与发现队列有样本重叠（无） 阅读提示：Results: 研究设计和多中心队列架构，Methods: 研究人群 |