肝纤维化诱导与消退模型建立
在C57BL/6J小鼠中通过CCl4或TAA给药12周诱导肝纤维化，随后停止诱导并分别设置1周或2周消退期。
小鼠分别经口灌胃CCl4（2 µl/g，3次/周，12周）或腹腔注射TAA（150 mg/kg，3次/周，12周），随后进入1周或2周的消退期。
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利奥西呱药理性刺激可溶性鸟苷酸环化酶在肝病消退实验模型中的影响
Impact of pharmacological sGC stimulation with Riociguat in experimental models of liver disease regression
实验完整度
高包含两种体内小鼠模型（CCl4和TAA诱导的肝纤维化消退模型），并进行了血流动力学、组织学、cGMP定量和全肝转录组学等多层级验证，同时涉及功能（门静脉压力）和机制（转录组）验证。
主要模型
C57BL/6J小鼠CCl4诱导肝纤维化消退模型 C57BL/6J小鼠TAA诱导肝纤维化消退模型
重点核对
肝纤维化诱导：CCl4灌胃（2 µl/g，3次/周，12周）或TAA腹腔注射（150 mg/kg，3次/周，12周） 消退期干预：Riociguat灌胃（3 mg/kg，2次/日）或赋形剂，持续1或2周 门静脉压力测量：麻醉下门静脉直接插管（26G针） 胶原面积比例（CPA）：天狼星红染色定量 肝脏cGMP水平：UPLC-MS/MS定量
摘要
背景：肝纤维化和门静脉高压（PH）决定了慢性肝病的预后。在实验模型中，刺激NO–sGC–cGMP信号可改善纤维化、门静脉高压和炎症。由于纤维化和门静脉高压在损伤停止后缓慢改善，我们研究了刺激sGC活性是否加速其消退。方法：通过四氯化碳（CCl4；2 µl/g，灌胃，每周3次）或硫代乙酰胺（TAA；150 mg/kg，腹腔注射，每周3次）诱导C57BL/6J小鼠肝纤维化12周，随后进行1（R1）或2（R2）周的消退期。在消退期间，动物接受sGC刺激剂利奥西呱（RIO；3 mg/kg，灌胃，每日2次）。通过门静脉压力（PP）、胶原面积比例（CPA）和全肝转录组学评估疾病严重程度。结果：PH和纤维化面积在TAA模型中达到峰值（PP：7.71±0.57 mmHg；CPA：3.87±0.19%），在CCl4模型中（PP：9.06±0.89 mmHg；CPA：9.43±2.59%），随后在R2时自发消退（TAA：PP：6.04±0.52 mmHg，CPA：2.90±0.30%；CCl4：PP：5.88±0.52 mmHg，CPA：6.66±1.45%）。RIO显著增加肝脏cGMP水平（CCl4–R2：5.89±0.58 nmol/L，R2+RIO：12.41±1.98 nmol/L）。虽然纤维化和门静脉高压的消退没有显著差异，但RIO治疗在两种模型中减弱了肝脏促炎基因特征，并在转录水平上改善了代谢通路。结论：利奥西呱增加肝脏cGMP生物利用度，并在两种实验性肝病消退模型中减轻炎症和代谢基因特征。虽然利奥西呱未加速肝纤维化和门静脉高压的消退，但我们的结果提示sGC刺激在肝病消退期间可能具有有益作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 在肝病消退阶段，药理性刺激sGC（使用Riociguat）是否能加速肝纤维化和门静脉高压的消退？
- 核心机制
- Riociguat通过刺激NO–sGC–cGMP通路增加肝脏cGMP水平，从而在转录水平上减轻炎症（如IL6–STAT3、TNF–NFkB信号）并改善代谢通路（如氧化磷酸化、糖异生、外源物代谢），但未显著影响纤维化和门静脉高压的消退。
- 主要证据
- 在CCl4和TAA诱导的肝纤维化消退小鼠模型中，Riociguat治疗显著增加肝脏cGMP水平（CCl4模型），转录组分析显示炎症通路下调且代谢通路富集，但门静脉压力和胶原面积比例无显著改善。
- 研究意义
- 研究表明sGC刺激在肝病消退期间可能发挥有益作用，支持其作为肝恢复期干预策略的进一步研究，尤其在纤维化持续存在或消退不完全的模型中。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
药物干预（Riociguat处理）
在消退期给予Riociguat或赋形剂，以评估sGC刺激对纤维化消退和门静脉高压的影响。
在消退期，小鼠接受Riociguat（3 mg/kg，灌胃，2次/日）或赋形剂（0.5% Natrosol + 0.015% Tween-80溶液，2次/日）。
体内表型评估
评估疾病严重程度及药物干预对门静脉压力、肝纤维化、肝损伤和代谢指标的影响。
在终点测量门静脉压力（PP）、胶原面积比例（CPA）、血清ALT、AST、血糖、血清胆汁酸、肝脏与脾脏/体重比等。
肝内cGMP水平定量
验证Riociguat是否有效激活sGC并增加肝内cGMP水平。
使用UPLC-MS/MS定量肝脏cGMP水平，样品用含2 mM IBMX的2%甲酸匀浆，经固相萃取纯化。
全肝转录组分析
鉴定自发消退和Riociguat治疗期间的基因表达变化，以揭示其潜在机制。
提取肝脏RNA，构建poly-A文库，进行RNA-seq，进行差异表达分析、GSEA和伪时间轨迹分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
诱导肝纤维化模型
检测肝内cGMP水平
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 利奥西呱 | -- | -- |
| 纤维化诱导 | 硫代乙酰胺 | -- | -- |
| 赋形剂 | 羟乙基纤维素 | -- | -- |
| 吐温-80 | -- | -- | |
| 门静脉压力测量 | 26G针头 | -- | -- |
| 聚乙烯管（0.4 mm内径，REF: 800/100/140） | Smiths Medical | 800/100/140 | |
| 压力传感器（MLT0380/D） | ADInstruments | MLT0380/D | |
| ML870 Power Lab 记录仪 | ADInstruments | -- | |
| 组织学 | 天狼星红染色液 | Morphisto | 13425 |
| 快绿染色液 | Sigma-Aldrich | 104022 | |
| 玻片扫描仪（Slideview VS200） | OLYMPUS | -- | |
| HALO图像分析软件 | Indica Labs | -- | |
| cGMP测量 | 异丁基甲基黄嘌呤 | -- | -- |
| cGMP-13C,15N2内标 | LGC Standards | TRC-G837962 | |
| cGMP标准品 | Merck | G7504 | |
| Oasis WAX 96孔板 | Waters Corporation | 186002502 | |
| Acquity Premier HSS T3色谱柱 | Waters Corporation | 186009468 | |
| AB Sciex 3Q MS 6500+质谱仪 | Sciex | -- | |
| 转录组学 | RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| Illumina NovaSeq测序平台 | Illumina | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 肝纤维化模型诱导 | CCl4剂量：2 µl/g（20% v/v橄榄油溶液），灌胃，每周3次，持续12周；TAA剂量：150 mg/kg（0.9%盐水溶液），腹腔注射，每周3次，持续12周；小鼠品系：C57BL/6J雄性，10周龄。 阅读提示：参见Materials and methods: Animal models |
| Riociguat给药 | Riociguat剂量：3 mg/kg，灌胃，每日2次；赋形剂：0.5% Natrosol + 0.015% Tween-80溶液；给药时间：消退期（1周或2周）。 阅读提示：参见Materials and methods: Animal models |
| 门静脉压力测量 | 麻醉：氯胺酮100 mg/kg和赛拉嗪7.5 mg/kg（体重调整）；测量方法：26G针直接门静脉插管，连接压力传感器。 阅读提示：参见Materials and methods: Hemodynamic readouts |
| 组织学分析 | 切片厚度：1 mm；染色：Picro-Sirius Red（PSR）和0.1% Fast-Green（FG）；定量：HALO图像分析软件；样本：外侧左叶。 阅读提示：参见Materials and methods: Histology |
| cGMP定量 | 检测方法：UPLC-MS/MS；样品制备：2%甲酸（含2 mM IBMX）匀浆；内标：1 µM cGMP-13C,15N2；校准曲线：0.2–1000 nM。 阅读提示：参见Materials and methods: Hepatic cGMP measurements |
| 转录组分析 | RNA提取：RNeasy Mini Kit；测序平台：Illumina NovaSeq（2x50 bp双端）；比对：GRCm38/mm10；样本量：每组n=8；分析方法：DESeq2、GSEA（MSigDB Hallmark）、ImpulseDE。 阅读提示：参见Materials and methods: Liver transcriptomics |