工程化酵母菌株构建
构建表面表达FnBP和分泌抗TNFα纳米抗体的双功能布拉氏酵母菌株。
将细菌来源的FnBP基因插入表面展示载体，整合至布拉氏酵母菌基因组，获得S.b. FN和S.b. FN-aTNF菌株；将抗TNFα纳米抗体基因插入分泌载体，整合至基因组，获得S.b. aTNF菌株。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
通过双功能益生酵母在炎症性肠病中进行靶向且定量建模的生物制剂递送
Targeted and quantitatively modeled biologic delivery via dual-functional probiotic yeast in inflammatory bowel disease
实验完整度
高包含体外结合与分泌表征、细胞活力验证、慢性DSS小鼠模型体内疗效与药代动力学验证，以及dSTORM超分辨成像和PK建模等多个独立证据层级。
主要模型
L929小鼠成纤维细胞系 慢性DSS诱导的C57BL/6小鼠结肠炎模型
重点核对
酵母菌株：S.b.野生型、S.b. FN、S.b. aTNF、S.b. FN-aTNF DSS诱导方案：6天2.5% DSS + 3天水，循环3次 酵母给药：从第9天开始，每3天口服灌胃1×10^9 CFU，共6次 小鼠品系：雌性C57BL/6，6-8周龄，每组8只 检测终点：粪便CFU、结肠长度、粪便Lipocalin-2、结肠组织学病变、结肠基因表达
摘要
基于益生菌的疗法是一类新兴的治疗干预措施，为管理慢性和炎症性疾病提供了一种有前景的策略。在这里，我们工程化了一种双功能益生酵母菌株——布拉氏酵母菌（Saccharomyces boulardii），旨在靶向胃肠道内的炎性病变并局部递送蛋白质治疗药物。我们采用了先进的实验和建模技术来表征工程化益生菌，并在炎症性肠病（IBD）小鼠模型中进行了临床前疗效和药代动力学验证。通过这些研究，我们证明了工程化酵母能够实现生物制剂的高效且局部递送，并具有延长的胃肠道滞留时间，驱动恢复性表型转变，从而带来可测量的疾病结局改善。总体而言，这项工作为工程化微生物疗法的开发建立了一个稳健的框架，代表了一种通过靶向、局部递送生物活性分子来治疗慢性炎症性疾病的综合性策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何通过工程化益生酵母实现炎症性肠病的靶向局部递送生物制剂并提升疗效？
- 核心机制
- 工程化布拉氏酵母菌通过表面表达纤连蛋白结合蛋白（FnBP）靶向肠道炎症部位富含的纤连蛋白，延长胃肠道滞留时间；同时分泌抗TNFα纳米抗体，局部中和TNFα，从而减轻炎症并促进组织修复。
- 主要证据
- 在慢性DSS结肠炎小鼠模型中，S.b. FN-aTNF处理组结肠长度显著增加，急性/过渡性病变比例降低至36%，而重塑病变比例升高至64%；粪便中纳米抗体浓度显著高于非靶向菌株和纳米抗体单独处理组；结肠组织中促炎基因（Il1b、Ccl2、Stat3、Cxcl2）表达显著下调，Foxp3表达上升。
- 研究意义
- 作者提出工程化益生酵母可作为口服递送生物制剂的平台，为IBD提供局部、微生态兼容的治疗策略，并建立PK建模框架用于指导剂量设计和疗效预测。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外功能表征
验证工程菌株的纤连蛋白结合能力和抗TNFα纳米抗体的分泌及中和活性。
通过流式细胞术检测S.b. FN与可溶性纤连蛋白的结合亲和力，计算解离常数；利用纤连蛋白包被的培养板评估黏附能力；通过成像流式细胞术和dSTORM分析FnBP的表面展示空间分布和密度；通过ELISA、SPR和Western blot验证纳米抗体的表达和结合亲和力；通过L929细胞毒性实验评估纳米抗体对TNFα诱导细胞死亡的中和作用。
药代动力学模型建立
建立数学模型预测酵母在体内的持久性和纳米抗体暴露，指导体内实验设计。
采用对数生长模型拟合体外盲肠滤液中的酵母生长和纳米抗体释放数据，并外推至小鼠体内两房室模型（胃肠道和粪便）。
体内药代动力学验证
在慢性DSS结肠炎模型中验证PK模型的预测，并评估工程酵母的靶向滞留和递送效率。
在DSS结肠炎小鼠模型中，通过口服灌胃给予工程酵母，定期检测粪便CFU和纳米抗体浓度，并与模型预测比较。
治疗疗效评估
评估双功能酵母在慢性结肠炎模型中的治疗效果。
通过体重变化、结肠长度、粪便Lipocalin-2、组织学评分、病变类型分析、免疫组化和转录组分析来评估疗效。
免疫调节分析
探究工程酵母对结肠免疫微环境的影响。
提取结肠组织RNA，通过qPCR检测免疫相关基因表达（如Foxp3、Ccl2、Il1b、Stat3等）。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 菌株培养 | YPD培养基 | 文中未明确说明 | -- |
| 模拟肠液 | Ricca Chemical Company | R7109750-500A | |
| 纤连蛋白结合实验 | 牛血浆纤连蛋白 | Sigma | F0287 |
| 流式细胞术 | 抗HA标签抗体（Alexa Fluor 488标记） | R&D Systems | IC6875G |
| 抗FLAG标签抗体（Alexa Fluor 594标记） | R&D Systems | IC8529T | |
| 抗纤连蛋白抗体 | Thermo | PA5-29578 | |
| 山羊抗兔AlexaFluor594抗体 | Thermo | A-11012 | |
| dSTORM成像 | 刀豆蛋白A | Vector Laboratories | L-1000-500 |
| 鬼笔环肽-AlexaFluor555 | Invitrogen | A30106 | |
| Everspark 2.0封片剂 | Idylle Labs | -- | |
| 蛋白纯化 | Ni-NTA树脂 | Thermo | 88221 |
| Western blot | NuPAGE Bis-Tris小型预制胶 | Invitrogen | -- |
| PageRuler Plus预染蛋白标记 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ECL化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| ELISA | 1-Step Ultra TMB-ELISA底物溶液 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| SPR | Biacore 8K表面等离子体共振仪 | Cytiva | -- |
| CM5传感芯片 | Cytiva | 29104988 | |
| L929细胞实验 | 小鼠肿瘤坏死因子α | Invitrogen | RMTNFAI |
| 免疫荧光 | 抗纤连蛋白抗体 | abcam | ab199056 |
| 抗TNFα抗体 | abcam | ab307164 | |
| Hoechst 33258核染料 | Invitrogen | H21491 | |
| ProLong Gold抗淬灭封片剂 | Thermo Fisher Scientific | P36930 | |
| 结肠外植体培养 | 两性霉素B | 文中未明确说明 | -- |
| mRNA提取 | Qiazol裂解试剂 | Qiagen | -- |
| cDNA合成 | iScript cDNA合成试剂盒 | Biorad | -- |
| qPCR | TaqMan探针 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| Fluidigm BioMark HD系统 | Fluidigm | -- | |
| 组织学 | 天狼星红染色 | 文中未明确说明 | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 酵母菌株构建 | 菌株背景（ura3/trp1双营养缺陷型）、质粒构建细节（启动子、信号肽、标签）、转化方法 (LiAc/PEG) 及线性化位点 阅读提示：Methods: Plasmid Construction and Yeast Transformation |
| 体外功能表征 | 纤维连蛋白结合实验条件（包被浓度、细胞密度、孵育时间）、流式检测抗体及浓度、L929细胞活力实验（TNFα和放线菌素D浓度） 阅读提示：Methods: Fibronectin Well Plate Attachment, Flow Cytometry, L929 TNFα Cytotoxicity Assay |
| 药代动力学模型 | 模型参数（kb, kd, kr, x, CCg, ke, Vg, kp, Mf）来源和数值 阅读提示：Results Section 5, Table 1, Supplemental Table 2 |
| 动物实验 | 小鼠品系、性别、年龄、DSS浓度和周期、酵母灌胃剂量和频率、每组动物数、粪便收集时间点 阅读提示：Methods: Animal Studies, Results Section 6, Figure 6A |
| 疗效评估 | 结肠长度测量方法、粪便Lipocalin-2 ELISA方案、组织学处理（固定、包埋、切片厚度、染色）、病变分类标准、qPCR引物和探针、基因表达计算方法 阅读提示：Methods: Histological Evaluation, mRNA Extraction and qPCR, Results Sections 7 and 8 |