TANGO2敲除hiPSC模型构建
生成携带TANGO2外显子3-9缺失的hiPSC-CMs，用于模拟TDD的细胞模型。
使用CRISPR/Cas9双sgRNA删除TANGO2外显子3-9，筛选两个克隆系，通过Western blot确认TANGO2蛋白缺失，并分化成心肌细胞。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
代谢危机和TRPM4激活导致TANGO2缺乏症中的QT延长
Metabolic crisis and TRPM4 activation cause QT prolongation in TANGO2 deficiency disorder
实验完整度
高包含临床病例、hiPSC-CM模型、代谢与电生理功能验证、机制验证（TRPM4敲低/抑制）及药物干预，证据层级多且含功能与机制验证。
主要模型
人诱导多能干细胞心肌细胞（hiPSC-CMs）TANGO2-/-模型 TDD临床病例（6岁男孩，TANGO2外显子3-9缺失）
重点核对
TANGO2基因敲除（外显子3-9缺失）细胞系的纯度与多能性验证 hiPSC-CMs分化成熟度（T3和Dex处理）确认 代谢底物条件（5.6 mmol/L葡萄糖、0.1 mmol/L棕榈酸、24小时禁食） 药物处理浓度（维拉帕米100 nmol/L、400 nmol/L，9-苯蒽酚10 µmol/L）
摘要
目的：TANGO2缺乏症（TDD）由TANGO2基因的双等位基因致病变异引起，与脂肪酸氧化受损和代谢危机相关，这些代谢危机常触发QT延长和心律失常。目的是研究TDD中QT延长和心律失常发生的机制。方法与结果：使用CRISPR/Cas9生成携带TANGO2外显子3-9缺失（TANGO2-/-）的人诱导多能干细胞心肌细胞（hiPSC-CMs）。在葡萄糖或棕榈酸燃料条件下研究生物能量功能（线粒体耗氧率、细胞内ATP/ADP比值）和动作电位（APs）。本研究报道了一例TDD临床病例，表现为QT延长和心律失常，对L型钙通道（LTCC）抑制剂维拉帕米或维生素B复合物补充治疗反应良好。使用TANGO2-/- hiPSC-CMs研究了临床表现和治疗反应的机制。在含葡萄糖的培养基中，对照组和TANGO2-/- hiPSC-CMs的生物能量功能相当。相反，使用棕榈酸作为能量底物导致TANGO2-/- hiPSC-CMs中细胞ATP产生率显著降低，ATP/ADP比值降低，24小时禁食加剧了这种情况。为期2周的维生素B5和B9治疗可预防这种危机。在危机期间，TANGO2-/- hiPSC-CMs表现出AP延长，通过细胞内递送Mg-ATP或肌酸激酶可预防这种情况。通过维拉帕米抑制LTCC，通过恢复ATP/ADP比值和细胞内Ca处理异常，预防了AP延长。重要的是，代谢危机上调了TRPM4（一种ATP和Ca调节的通道）。TRPM4 siRNA敲低或药理学阻断可预防AP延长，但不能挽救TANGO2-/- hiPSC-CMs的能量缺乏。结论：这些发现表明TDD中ATP缺乏与TRPM4激活和AP延长之间存在机制联系。治疗性靶向TRPM4可能有助于预防TDD危机中的QT延长和心脏心律失常。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TANGO2缺乏症中代谢危机与QT延长及心律失常之间的机制联系是什么？
- 核心机制
- TANGO2缺乏导致棕榈酸氧化受损，引起ATP缺乏，解除对TRPM4的抑制并激活TRPM4，导致动作电位延长和心律失常。
- 主要证据
- 使用TANGO2-/- hiPSC-CMs，在棕榈酸条件下观察到ATP/ADP比值降低、APD90延长和AP交替；TRPM4敲低或抑制可逆转AP延长，而不改善能量缺乏；维生素B5/B9补充恢复棕榈酸氧化。
- 研究意义
- 该研究将TRPM4确立为连接代谢功能障碍与电学异常的关键分子，为预防TDD代谢危机期间的心律失常提供了新的治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
代谢底物下的细胞能量功能检测
评估不同代谢底物（葡萄糖和棕榈酸）对TANGO2-/- hiPSC-CMs线粒体功能和ATP产生的影响。
在含5.6 mmol/L葡萄糖或0.1 mmol/L棕榈酸条件下，测量细胞内ATP/ADP比值、Seahorse耗氧率（OCR）和ATP产生率，并进行24小时禁食处理。
维生素B5/B9治疗对棕榈酸氧化的影响
验证维生素B5和B9组合补充能否纠正TANGO2-/- hiPSC-CMs中受损的棕榈酸氧化和ATP缺乏。
用维生素B5（0.05 mmol/L）、B9（0.05 mmol/L）或组合（各0.025 mmol/L）处理2周，然后测定棕榈酸依赖性OCR和ATP产生率。
代谢底物依赖性电生理检测（场电位和动作电位）
研究不同代谢条件对TANGO2-/- hiPSC-CMs电活动的影响，表征QT延长和心律失常表现。
记录在葡萄糖、棕榈酸及禁食后棕榈酸条件下的场电位（EFP）和单细胞动作电位（AP），量化FPD、APD90、交替等参数。
验证ATP缺乏在AP延长中的作用
通过补充ATP或肌酸激酶，验证ATP缺乏是否是AP延长的直接原因。
在膜片钳记录时，通过电极内液递送2.5单位肌酸激酶和2 mmol/L磷酸肌酸，或10 mmol/L Mg-ATP，观察AP变化。
LTCC阻断剂对AP和钙处理的影响
评估维拉帕米和地尔硫卓对TANGO2-/- hiPSC-CMs中AP延长和钙异常的改善作用。
急性给予400 nmol/L维拉帕米或500 nmol/L地尔硫卓，记录AP；并单独用100 nmol/L维拉帕米预处理1小时，测量细胞内钙瞬变和钙处理参数。
TRPM4表达及功能验证
验证TRPM4在代谢危机中上调，并通过药理学抑制或基因敲低确认其介导AP延长。
RT-qPCR检测TRPM4 mRNA表达；使用TRPM4抑制剂9-苯蒽酚（10 µmol/L）和siRNA敲低，测量APD90和能量参数。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因编辑与模型构建
代谢与生物能量分析
钙成像分析
基因功能干预
产品清单
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞模型 | TANGO2-/- hiPSC细胞系的敲除效率及克隆选择；分化方案中T3和Dex的浓度和时间 阅读提示：Methods中hiPSC生成与分化部分，补充材料图S1 |
| 代谢应激条件 | 培养基中葡萄糖（5.6 mmol/L）和棕榈酸（0.1 mmol/L）浓度；禁食24小时；检测ATP/ADP比值和OCR 阅读提示：Results 3.3节，图2及其图注 |
| 电生理记录 | 场电位记录时的刺激频率（1 Hz）和温度（37°C）；动作电位记录时的刺激频率（0.5 Hz）和电极内液组成 阅读提示：Results 3.5节，图3和图4的图注及相关方法 |
| 药物干预 | 维拉帕米处理浓度（100 nmol/L预处理1小时，400 nmol/L急性）及时间 阅读提示：Results 3.5和3.7节，图5和图6图注 |
| 维生素B处理 | 维生素B5和B9的浓度（各0.05 mmol/L或组合各0.025 mmol/L）及处理时间（2周） 阅读提示：Results 3.4节，补充图S7 |
| TRPM4功能研究 | TRPM4抑制剂9-苯蒽酚浓度（10 µmol/L）及孵育时间；siRNA转染条件（浓度和时间） 阅读提示：Results 3.8节，图7及补充图S14-S15 |