样本采集与寄生检测
获取足量B. tropicus螺样本,并检测其是否感染目标吸虫物种。
在乌干达西部34个火山口湖中,使用金属筛(4 mm网孔)沿湖岸浅水区取样约45分钟,收集螺,热激处死后保存于80%乙醇。通过快速诊断多重PCR(RD-PCR)检测吸虫感染,并对感染螺进行高通量扩增子测序(HTAS)。
Contrasting patterns of trematode and host snail dispersal across clusters of tropical crater lakes
包含中宿主螺和三种吸虫的种群遗传分析、分子方差分析、单倍型网络构建及中性检验,证据层级完整。
Bulinus tropicus螺种群 Petasiger sp.吸虫种群 Echinoparyphium sp.吸虫种群 Plagiorchioidea sp.吸虫种群
地理范围:15个火山口湖,分布在两个湖群(Ndali-Kasenda和Bunyaruguru),相距约100 km 样本量:823只Bulinus tropicus螺,298个Petasiger sp.,109个Echinoparyphium sp.,217个Plagiorchioidea sp. 遗传标记:线粒体COI1、COI2、NAD1(螺),COI1、COI2、NAD1、cytb(吸虫) 分析:AMOVA(10,000次排列),Mantel检验(10,000次排列),单倍型网络
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获取足量B. tropicus螺样本,并检测其是否感染目标吸虫物种。
在乌干达西部34个火山口湖中,使用金属筛(4 mm网孔)沿湖岸浅水区取样约45分钟,收集螺,热激处死后保存于80%乙醇。通过快速诊断多重PCR(RD-PCR)检测吸虫感染,并对感染螺进行高通量扩增子测序(HTAS)。
获取螺和吸虫的线粒体序列,用于种群遗传分析。
使用E.Z.NA Mollusc DNA Kit提取DNA,通过HTAS在一次多重PCR中扩增多个标记:螺的ITS1、COI1、COI2、NAD1;吸虫的ITS2、COI1、COI2、NAD1、cytb。使用Illumina MiSeq v3平台(300 bp双端)测序。
获得每个样本的高质量序列变异(ASV)用于后续遗传分析。
对测序reads进行质量控制和ASV推断,使用dada2流程;过滤低支持度的ASV以避免假阳性。感染判定基于ASV出现。
比较不同物种和种群的遗传多样性参数(单倍型多样性、核苷酸多样性)。
使用Geneious Prime和MUSCLE进行序列比对,检查NUMTs;使用Arlequin计算单倍型数、多态位点数、单倍型多样性、核苷酸多样性;使用Wilcoxon检验比较多样性指标。
评估不同地理尺度(湖泊间、湖群间)的遗传分化。
使用MEGA 11选择替换模型,然后在Arlequin中进行分层AMOVA(10,000次排列),计算ΦST、ΦCT、ΦSC,并进行配对ΦST比较。构建TCS单倍型网络(在PopART中)。
检验遗传距离与地理距离之间的相关性。
使用Mantel检验(10,000次排列)分析遗传距离(Slatkin's距离)与地理距离的相关性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| DNA提取 | E.Z.NA软体动物DNA试剂盒 | OMEGA Bio-tek | -- |
| 测序 | Illumina Miseq v3平台 | Illumina | -- |
| 样本采集 | 金属筛 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本采集 | 采集时间(2019年2月);湖泊选择(34个,其中15个用于分析,每个湖≥50只螺);采集方法(金属筛网孔4 mm,沿20米湖岸取样约45分钟)。 阅读提示:Methods部分:Material collection |
| DNA提取 | DNA提取试剂盒(E.Z.NA Mollusc DNA Kit)及制造商说明;DNA稀释浓度(1:10)。 阅读提示:Methods部分:Molecular characterisation of snails and trematodes |
| HTAS测序 | 扩增子测序平台(Illumina MiSeq v3,300 bp paired-end);多重PCR标记设计;文库构建和索引策略(每~500只螺并行测序)。 阅读提示:Methods部分:Amplicon sequencing and read processing |
| 种群遗传分析 | 用于AMOVA的替换模型选择;AMOVA排列次数(10,000);Mantel检验排列次数(10,000)。 阅读提示:Methods部分:Analyses of the genetic diversity and structure;表2图注 |
| 遗传多样性 | 比较遗传多样性时,样本量≥5的种群;排除线粒体标记中未成功扩增的样品(如Echinoparyphium sp.的COI1和COI2)。 阅读提示:Methods部分:Population- and marker-specific genetic diversity;表S4、S5、S6 |