化合物发现与结构优化
基于MI-3454的晶体结构，通过结构导向设计优化，发现ziftomenib。
利用menin-MI-3454复合物晶体结构（PDB 6O5I），在吲哚氮位置引入手性烷基连接的甲磺酰哌嗪取代基，设计合成ziftomenib，并通过FP实验测定其抑制menin-KMT2A相互作用的IC50。
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menin-KMT2A抑制剂ziftomenib在急性白血病模型中的发现及临床前活性
Discovery and preclinical activity of the menin-KMT2A inhibitor ziftomenib in acute leukemia models
实验完整度
高包含体外细胞实验、原代样本集落形成实验、多种异种移植及PDX模型、CRISPR基因编辑、晶体结构解析、体内药效及机制验证等多层级证据。
主要模型
KMT2A重排白血病细胞系（MV4;11、MOLM13、KOPN-8、SEM、RS4;11） NPM1突变白血病细胞系OCI-AML3 NUP98-NSD1转化的鼠骨髓细胞 患者来源异种移植模型（KMT2A-1532、KMT2A-0324、KMT2A-0324R、NPM1-5969）
重点核对
MV4;11和MOLM13异种移植模型中的ziftomenib给药方案（100 mg/kg或150 mg/kg，口服，每日一次或每日两次） MEN1突变体细胞系的生成与验证（CRISPR-Cas9介导的T349M、M327I、G331D、G331R突变） ziftomenib对menin-KMT2A相互作用的抑制活性（FP实验IC50值） 体外细胞活力检测的ziftomenib浓度范围（GI50值）与处理时间（7-17天） 体内实验中ziftomenib的给药途径、剂量和频率以及药代动力学参数（Cmax、AUC）
摘要
menin与KMT2A（组蛋白赖氨酸甲基转移酶2A）之间的蛋白-蛋白相互作用在伴有KMT2A重排、核磷蛋白1（NPM1）突变和核孔蛋白98重排的急性白血病中发挥关键作用，并代表了新兴的治疗干预机会。在此，我们报告了ziftomenib作为一种口服生物利用度高、高效且选择性的menin-KMT2A相互作用小分子抑制剂的开发及全面评估。在具有menin-KMT2A依赖性的白血病细胞和原代患者样本中，ziftomenib显著抑制增殖、降低集落形成潜能并诱导分化，这与menin-KMT2A靶基因（包括MEIS1、HOXA9和HOXB2）的强烈下调相关。在KMT2A重排白血病的异种移植和患者来源异种移植模型中，ziftomenib诱导白血病消退或降低白血病负荷，并伴随menin-KMT2A靶基因的显著减少。接下来，我们评估了ziftomenib针对与另一种menin抑制剂revumenib的临床耐药相关的4种MEN1（编码menin的基因）突变体（T349M、M327I、G331R、G331D）的活性。Ziftomenib对T349M突变细胞保留了抗白血病活性，并对G331R细胞表现出低纳摩尔效力（50%生长抑制≤25 nM），尽管相对于MEN1野生型细胞效力降低数倍，而M327I和G331D突变体则耐药。Ziftomenib与menin野生型、T349M或G331R突变体复合物的晶体结构揭示了ziftomenib与这些menin变体的相似结合模式，从而解释了针对这些突变体的有效抑制活性。Ziftomenib最近已获得美国食品药品监督管理局批准用于NPM1突变的急性髓系白血病成人患者，并继续在NPM1或KMT2A改变的白血病中进行临床评估，既作为单药治疗也作为联合治疗。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- ziftomenib作为menin-KMT2A相互作用抑制剂，在menin-KMT2A依赖的急性白血病模型（包括KMT2A重排、NPM1突变、NUP98重排）中的临床前活性如何，以及其对revumenib诱导的MEN1耐药突变体的效应如何？
- 核心机制
- Ziftomenib通过占据menin上的KMT2A结合位点，阻断menin-KMT2A相互作用，导致KMT2A靶基因（如MEIS1、HOXA9）下调，从而抑制白血病细胞增殖、诱导分化。其对部分耐药突变（T349M、G331R）保留活性的机制是保持了相似的结合模式。
- 主要证据
- 在多种KMT2A重排和NPM1突变细胞系中，ziftomenib以低纳摩尔浓度抑制增殖（GI50=4.5-28 nM），下调MEIS1、HOXA9等靶基因，并在异种移植和PDX模型中诱导白血病消退或降低负荷。晶体结构显示其与menin T349M和G331R突变体结合模式相似。
- 研究意义
- Ziftomenib已获FDA批准用于NPM1突变AML患者，且对revumenib诱导的MEN1突变（T349M、G331R）展示出潜在优势，提示其可能为耐药患者提供治疗选择，并支持进一步的临床开发。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞活性与机制验证
评估ziftomenib对menin-KMT2A依赖的白血病细胞活力的影响，并验证其作用机制。
用不同浓度ziftomenib处理多种KMT2A重排（MV4;11、MOLM13等）和NPM1突变（OCI-AML3）或NUP98-NSD1转化的细胞，通过MTT实验测定细胞活力，通过流式细胞术检测分化标志物（CD11b、CD14、Gr1）和凋亡（Annexin V），并通过RT-qPCR检测靶基因表达变化。
原代患者样本集落形成实验
评估ziftomenib对原代白血病患者样本的集落形成能力的影响。
将原代白血病患者样本（KMT2A-r、NPM1-mut、NUP98-r）与ziftomenib或DMSO混合在MethoCult 4435中，培养10-14天，计数集落并观察集落大小和形态。
体内药效评估（异种移植和PDX模型）
评估ziftomenib在体内对KMT2A-r白血病模型的疗效和耐受性。
在NSG或NSGS小鼠中移植MV4;11、MOLM13细胞或PDX样本，用ziftomenib或载体处理，监测白血病进展（生物发光成像或流式检测人CD45+细胞），评估生存期，并检测靶基因表达。
对耐药menin突变体的活性及结构机制研究
评估ziftomenib对revumenib诱导的MEN1突变体的活性，并解析其结合模式。
通过FP实验检测ziftomenib对野生型及突变体menin（T349M、M327I、G331R、G331D）的抑制活性，并通过共结晶解析复合物结构。在CRISPR-Cas9生成的MEN1突变细胞系中检测ziftomenib的抗增殖、凋亡、分化和基因表达变化，并在体内异种移植模型验证对T349M和M327I的效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 化学合成 | Ziftomenib | -- | -- |
| 荧光偏振实验 | PHERAstar酶标仪 | BMG Labtech | -- |
| 细胞培养与处理 | MethoCult 4435培养基 | STEMCELL | 4435 |
| RNeasy Mini试剂盒 | Qiagen | -- | |
| 基因表达分析 | High-Capacity cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 |
| CFX96 Touch实时荧光定量PCR检测系统 | Bio-Rad | -- | |
| 流式细胞术 | FACSCelesta流式细胞仪 | BD Biosciences | -- |
| 抗人CD45抗体 | BD Biosciences | 563879 | |
| 体内实验 | NSG小鼠 | Jackson Laboratory | -- |
| NSGS小鼠 | -- | -- | |
| 20% (2-羟丙基)-β-环糊精 | -- | -- | |
| 聚氧乙烯蓖麻油 | BASF | -- | |
| 染色 | HEMA3染色试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | -- |
| 基因编辑 | 高保真Cas9蛋白 | Integrated DNA Technologies | -- |
| Alt-R同源定向修复供体寡核苷酸 | Integrated DNA Technologies | -- | |
| NEON转染系统 | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | |
| 细胞培养 | MethoCult 4434培养基 | STEMCELL | 4434 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞系和培养条件 | 细胞系来源，培养条件（如RPMI 1640添加物、胎牛血清浓度、抗生素），细胞密度和传代方法 阅读提示：Methods: 细胞培养与处理（补充材料） |
| 药物处理 | ziftomenib的处理浓度、时间、溶剂（DMSO）及浓度范围，以及溶剂对照 阅读提示：Methods: Viability assays and flow cytometry analysis；Figure 1 图注 |
| 细胞活力测定 | MTT实验的具体步骤，包括细胞铺板密度、处理时间、MTT孵育时间、波长和读数方法 阅读提示：Methods: Viability assays and flow cytometry analysis；Figure 1D 图注 |
| 流式细胞术 | 检测的抗体（如CD11b、CD135、Annexin V）、染色步骤、仪器型号和数据分析软件 阅读提示：Methods: Viability assays and flow cytometry analysis；Figure 1E-F 图注 |
| 集落形成实验 | 细胞培养基质（MethoCult 4435）、细胞密度、ziftomenib浓度、培养时间和集落计数标准 阅读提示：Methods: Colony forming assay；Figure 2 图注 |
| 基因表达分析 | RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、qPCR仪器、内参基因（HPRT1）以及目标基因 阅读提示：Methods: Gene expression studies；Figure 1H 图注 |
| 异种移植和PDX模型 | 小鼠品系（NSG）、细胞系和细胞数量、给药途径、剂量和频率、监测方法（生物发光或流式）、安乐死标准 阅读提示：Methods: Xenograft and PDX experiments；Figure 3-4 图注 |
| MEN1突变细胞系生成 | CRISPR-Cas9编辑方法，包括gRNA序列、供体寡核苷酸、电转条件、单克隆筛选和测序验证 阅读提示：Methods: Generation of MEN1 mutant leukemia cell lines；Figure 6A 图注 |
| 结晶和结构解析 | menin蛋白浓度、ziftomenib摩尔比、结晶条件、数据收集和结构解析软件 阅读提示：Methods: Crystallization of menin mutant–ziftomenib complexes；Figure 5 图注 |