评估cDC亚群线粒体呼吸对免疫刺激的响应
比较cDC1和cDC2在静息和TLR刺激下线粒体呼吸的变化
从FLDC培养中纯化cDC1和cDC2，用CpG、poly(I:C)或R848刺激1、4、20小时，测定OCR和ECAR。
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线粒体代谢调节树突状细胞的免疫原性反应性
Mitochondrial metabolism regulates the immunogenic responsiveness of dendritic cells
实验完整度
高包含体外细胞实验、体内小鼠模型、人类样本、多种组学（RNA-seq、ATAC-seq、甲基化芯片、WGBS）及功能验证（T细胞增殖、迁移、抗肿瘤实验），并进行了机制验证（AOX挽救、Tet2缺陷模拟）。
主要模型
小鼠脾脏cDC1和cDC2 人外周血CD141+ cDC1和CD1c+ cDC2 Flt3L培养的骨髓来源树突状细胞（FLDCs） B16-OVA黑色素瘤小鼠模型
重点核对
小鼠基因型：Uqcrqf/f和ItgaxΔUqcrq，以及AoxRosa26和Tet2ko/ko 刺激条件：体内静脉注射poly(I:C) LMW和R848各50μg，或体外培养用20μg/ml poly(I:C) LMW、1μg/ml R848、5μg/ml CpG ODN1826 复合物III抑制剂处理：Antimycin A (5nM) 或 Myxothiazol (1nM) 刺激前15分钟 检测时间点：体内刺激后1.5、4、16小时，体外刺激后4小时（小鼠）或6小时（人） T细胞增殖实验：OT-II细胞与cDC共培养5天，通过CellTrace Violet稀释检测
摘要
常规树突状细胞（cDCs）的活化有利于糖酵解驱动的乳酸发酵，而氧化磷酸化（OXPHOS）与耐受性相关。在这里，选择性靶向cDCs中的线粒体电子传递链（ETC）揭示了OXPHOS在调节其免疫原性中的关键作用。ETC复合物III的破坏减弱了佐剂触发的人和小鼠cDC1的原代活化及其启动T细胞抗肿瘤免疫的能力，而对cDC2的影响较轻。机制上，cDC1中复合物III的损伤导致氧化还原和代谢物平衡失调，改变了PU.1和激活蛋白-1（AP-1）结合区域的DNA甲基化。这些表观遗传改变阻碍了cDC1在刺激后快速诱导立早基因。ETC受损的cDC1免疫原性反应性降低可通过异位表达交替氧化酶恢复，并可通过Tet2缺陷模拟。我们的发现揭示，通过ETC的电子流维持cDC1的预激活状态，这对于有效的抗肿瘤免疫至关重要。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）如何调节常规树突状细胞亚群的免疫原性反应性？
- 核心机制
- 线粒体电子传递链（ETC）通过维持cDC1中的氧化还原（NAD+/NADH比值）和代谢物平衡（如2-HG/α-KG比值），调节PU.1和AP-1结合区域的DNA甲基化，从而预置立早免疫刺激诱导基因的快速诱导，确保cDC1的免疫原性激活。
- 主要证据
- 通过Uqcrq敲除或CIII抑制剂破坏ETC，导致cDC1激活标志物表达降低、迁移和T细胞启动能力受损；AOX表达恢复ETC电子流可逆转这些缺陷；Tet2缺陷模拟了CIII损伤的表型。
- 研究意义
- 研究揭示了ETC/OXPHOS活性分级调节cDC亚群免疫原性反应性的代谢机制，提供了通过调节线粒体代谢或TET2活性来增强cDC1免疫原性的潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生成并表征ETC受损小鼠模型
建立CIII或CIV缺陷的cDC特异性敲除小鼠，验证ETC损伤对cDC功能的影响
将Uqcrqf/f和Cox10fl/fl小鼠与ItgaxCre小鼠杂交，获得ItgaxΔUqcrq和ItgaxΔCox10小鼠，验证Uqcrq和Cox10表达缺失，并评估线粒体呼吸和ETC复合物水平。
检测ETC损伤对cDC激活和迁移的影响
确定ETC损伤是否影响cDC激活标志物表达和体内迁移能力
用R848、PIC或PBS处理小鼠，4或16小时后通过流式检测脾脏和淋巴结cDC表面激活分子；进行足垫转移实验检测迁移。
评估ETC损伤对T细胞启动和抗肿瘤免疫的影响
检测ETC受损的cDC1是否影响CD4+ T细胞增殖和CD8+ T细胞抗肿瘤免疫
分离cDC1和cDC2，负载OVA蛋白并刺激，与OT-II T细胞共培养；或将OVA负载的cDC1过继转移至B16-OVA荷瘤小鼠，检测肿瘤结节。
转录组分析ETC损伤的cDC
鉴定ETC损伤对cDC基因表达的影响，特别是免疫相关通路
对静息或刺激的cDC1和cDC2进行RNA-seq，通过GSEA和IPA分析差异表达基因和通路富集。
表观遗传分析：ATAC-seq和DNA甲基化
检查ETC损伤是否改变染色质可及性和DNA甲基化
对cDC1和cDC2进行ATAC-seq和DNA甲基化芯片分析，鉴定DMPs和TF基序富集。
代谢物和氧化还原状态分析
探究ETC损伤如何影响cDC1的代谢物和氧化还原平衡
使用试剂盒或LC-MS测量NAD+/NADH、ATP、ROS和代谢物浓度。
AOX表达挽救实验
验证ETC电子流而非ATP/ROS是维持cDC1免疫原性的关键
在ItgaxΔUqcrq小鼠中表达AOX，评估代谢物、DNA甲基化、激活标志物和抗肿瘤能力的恢复。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫效应
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | -- |
| 细胞分离 | 小鼠CD11c磁珠 | Miltenyi Biotec | 130-125-835 |
| CD8+树突状细胞分离试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-091-169 | |
| 人泛DC富集试剂盒 | Miltenyi Biotec | 130-100-777 | |
| 细胞培养 | 人Flt3配体 | Miltenyi Biotec | 120-096-474 |
| 细胞刺激 | 聚肌胞苷酸（低分子量） | Invivogen | tlrl-picw |
| R848（瑞喹莫德） | Invivogen | tlrl-r848-5 | |
| CpG寡脱氧核苷酸1826 | Invivogen | tlrl-1826-1 | |
| 线粒体功能检测 | 寡霉素 | Sigma-Aldrich | O4876 |
| 鱼藤酮 | Sigma-Aldrich | R8875 | |
| 甲氧噻唑 | Sigma-Aldrich | T5580 | |
| 四甲基罗丹明甲酯高氯酸盐 | Sigma-Aldrich | T5428 | |
| 二氢乙啶 | Sigma-Aldrich | D11347 | |
| 细胞增殖检测 | CellTrace紫 | Invitrogen | C34557 |
| CellTrace CFSE细胞增殖试剂盒 | Invitrogen | C34554 | |
| 代谢物检测 | NAD/NADH-Glo检测试剂盒 | Promega | G9071 |
| 发光ATP检测试剂盒 | Abcam | ab113849 | |
| 分子生物学 | RNeasy微量试剂盒 | QIAGEN | 74004 |
| QIAamp DNA微量试剂盒 | QIAGEN | 51304 | |
| 高容量cDNA逆转录试剂盒 | Applied Biosystems | 4368814 | |
| GoTaq qPCR预混液 | Promega | A6001 | |
| 代谢分析 | Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 103792-100 |
| 表观遗传分析 | EZ DNA甲基化金试剂盒 | Zymo Research | D5006 |
| 抗体 | 抗小鼠CD16/CD32抗体，克隆2.4G2 | Tonbo Biosciences | 70-0161 |
| 抗小鼠CD45.1抗体，克隆A20 | eBioscience | 17-0453-82 | |
| 抗小鼠CD44抗体，克隆IM7 | eBioscience | 11-0441-82 | |
| 抗小鼠CD62L抗体，克隆MEL-14 | eBioscience | 12-0621-82 | |
| 抗小鼠CD8抗体，克隆53-6.7 | BD Biosciences | 561967 | |
| 抗小鼠CD11b抗体，克隆M1/70 | BD Biosciences | 561098 | |
| 抗小鼠I-A/I-E抗体，克隆2G9 | BD Biosciences | 562009 | |
| 抗小鼠SIRPα抗体，克隆P84 | BD Biosciences | 770060 | |
| 抗小鼠CD40抗体，克隆3/23 | BD Biosciences | 558695 | |
| 抗小鼠CD3抗体，克隆17A2 | BD Biosciences | 565643 | |
| 抗小鼠CD11c抗体，克隆N418 | BioLegend | 117352 | |
| 抗小鼠XCR1抗体，克隆ZET | BioLegend | 148204 | |
| 抗小鼠B220抗体，克隆C363-16A | BioLegend | 103202 | |
| 抗小鼠CD80抗体，克隆16-10A1 | BioLegend | 104714 | |
| 抗小鼠CD45.2抗体，克隆104 | BioLegend | 109808 | |
| 抗小鼠CD90抗体，克隆53-2.1 | BioLegend | 140312 | |
| 抗小鼠CCR3抗体，克隆J073E5 | BioLegend | 144506 | |
| 抗小鼠CCR7抗体，克隆4B12 | BioLegend | 120124 | |
| 抗小鼠OX40L抗体，克隆RM134L | BioLegend | 108814 | |
| 抗小鼠PDL1抗体，克隆10F.962 | BioLegend | 155404 | |
| 抗小鼠CD19抗体，克隆6D5 | BioLegend | 115506 | |
| 抗小鼠CD24抗体，克隆M1/69 | BioLegend | 114308 | |
| 抗小鼠B220抗体，克隆RA3-6B2 | BioLegend | 103208 | |
| 抗小鼠H-2Kb/H-2Db抗体，克隆28-8-6 | BioLegend | 114608 | |
| 抗小鼠CD86抗体，克隆GL1 | ThermoFisher | PE-65068 | |
| 抗小鼠FOXP3抗体，克隆FJK-16s | Invitrogen | 11-5773-82 | |
| 抗小鼠CD25抗体，克隆PC61.5 | Tonbo Biosciences | 50-0251 | |
| 抗小鼠IFNγ抗体，克隆XMG1.2 | BioLegend | 505826 | |
| 抗人CD141抗体，克隆AD5-14H12 | Miltenyi Biotec | 130-113-317 | |
| 抗人CD1c抗体，克隆L161 | BioLegend | 331502 | |
| 抗人HLA-DR抗体，克隆L243 | BioLegend | 307634 | |
| 抗人CD80抗体，克隆2D10 | BioLegend | 305208 | |
| 抗人CD86抗体，克隆2331(FUN-1) | BD Biosciences | 555655 | |
| 抗NDUFA9抗体，克隆20C11B11B11 | Invitrogen | 459100 | |
| 抗SDHA抗体，克隆2E3GC12FB2AE2 | Invitrogen | 459200 | |
| 抗UQCRC1抗体，克隆16D10AD9AH5 | Abcam | ab110252 | |
| 抗UQCRC2抗体，克隆14742-1-AP | Proteintech | 14742-1-AP | |
| 抗COX1抗体，克隆1D6E1A8 | Invitrogen | 459600 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 小鼠模型 | 基因型：Uqcrqf/f和ItgaxΔUcrq，以及AoxRosa26和Tet2ko/ko；年龄6-11周；性别匹配 阅读提示：STAR Methods - Mice |
| cDC分离和培养 | 细胞来源：脾脏或FLDC培养；分离方法：CD11c磁珠纯化后FACS分选 阅读提示：STAR Methods - Mouse dendritic cell in vivo expansion, enrichment and purification |
| 体外刺激 | 刺激剂及浓度：LPS-EK (100 ng/ml), poly(I:C) LMW (20 μg/ml), CpG ODN1826 (5 μg/ml), R848 (1 μg/ml)；刺激时间：4小时 阅读提示：STAR Methods - In vivo and ex vivo activation of mouse and human DCs |
| 体内刺激 | 给药途径：静脉注射；剂量：poly(I:C) LMW和R848各50 μg；时间点：1.5、4、16小时 阅读提示：STAR Methods - In vivo and ex vivo activation of mouse and human DCs |
| 代谢检测 | Mito Stress test条件：Oligomycin (1 μM), FCCP (1 μM), Rotenone (1 μM), Antimycin A (1 μM)；细胞数量：2-3x10^5 阅读提示：STAR Methods - Extracellular flux analysis |
| T细胞增殖实验 | OT-II细胞纯化及标记：CellTrace Violet；共培养比例1:1；时间5天 阅读提示：STAR Methods - OT-II cell proliferation and in vivo assays |