验证近视过程中巩膜Postn启动子H3K18la富集及表达变化
确认H3K18la是否在Postn启动子区域富集并伴随Postn表达上调。
在FDM小鼠中，通过CUT&Tag-qPCR检测Postn启动子H3K18la富集，通过RT-qPCR和免疫印迹检测Postn mRNA和蛋白水平。
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巩膜Postn通过促进肌成纤维细胞转分化驱动近视
Scleral Postn Drives Myopia via Promoting Myofibroblast Transdifferentiation
实验完整度
高包含体外细胞实验（HSFs）和体内小鼠FDM模型，且具有功能获得/丧失验证及机制研究（co-IP、AKT通路）。
主要模型
C57BL/6小鼠形觉剥夺性近视（FDM）模型 人巩膜成纤维细胞（HSFs）
重点核对
FDM诱导：使用透光率约20%-30%的弥散镜片遮盖右眼 AAV8-POSTN或AAV8-shRNA-POSTN的球后Tenon囊注射剂量（5×10^12至1×10^13基因组拷贝/mL） HSFs处理：缺氧（1% O2）或乳酸（20 mM）处理48小时 rhPOSTN处理浓度：10、25、50 ng/mL处理24小时 整合素中和抗体：抗整合素αvβ5（2.5 µg/mL）预孵育30分钟
摘要
目的：我们之前发现巩膜缺氧导致糖酵解-乳酸-组蛋白H3K18乳酸化（H3K18la）级联反应，这有助于近视。由于Cut&Tag鉴定Postn为H3K18la富集的主要细胞外基质（ECM）基因，其编码periostin（Postn）蛋白，本研究旨在探讨Postn是否通过调节巩膜ECM重塑驱动近视。方法：通过CUT&Tag-定量PCR验证Postn启动子处H3K18la富集。通过逆转录定量PCR（RT-qPCR）和免疫印迹评估小鼠形觉剥夺性近视（FDM）过程中巩膜Postn水平。进行功能获得或丧失实验以评估巩膜Postn在正常屈光发育或FDM中的作用。在FDM小鼠和人巩膜成纤维细胞（HSFs）中使用免疫印迹、免疫共沉淀、基因操作和重组人POSTN（rhPOSTN）蛋白处理探索机制。结果：近视期间Postn启动子区域H3K18la富集以及Postn mRNA和蛋白水平均增加。在HSFs中，POSTN敲低抑制了缺氧或乳酸诱导的成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化（FMT）的升高，并挽救I型胶原蛋白的下降。巩膜Postn过表达诱导小鼠近视，而其敲低减弱了FDM的发展。机制上，Postn结合整合素αvβ3和αvβ5受体以激活AKT信号通路，驱动FMT并抑制I型胶原蛋白。结论：巩膜Postn通过促进巩膜FMT而有助于近视。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 巩膜Postn是否通过调节巩膜ECM重塑驱动近视，其潜在机制是什么？
- 核心机制
- Postn通过结合整合素αvβ3和αvβ5受体激活AKT信号通路，从而促进成纤维细胞向肌成纤维细胞转分化（FMT），抑制I型胶原蛋白表达，最终导致巩膜ECM重塑和近视进展。
- 主要证据
- 在FDM小鼠和HSFs中，Postn过表达诱导肌成纤维细胞标志物α-SMA升高和I型胶原蛋白下降，而Postn敲低则抑制这些变化；免疫共沉淀显示Postn与整合素αvβ3/αvβ5相互作用并增强AKT磷酸化；使用中和抗体或siRNA阻断整合素αvβ5或ITGB3可消除rhPOSTN诱导的效应。
- 研究意义
- 该研究揭示了Postn作为H3K18la的新靶点，通过激活AKT信号促进FMT参与近视发病，为近视治疗提供了潜在的新靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证乳酸/H3K18la对Postn表达的调控
确定乳酸积累是否通过p300介导的H3K18la促进Postn表达。
在小鼠巩膜中过表达或敲低LDHA，在HSFs中使用siRNA敲低LDHA或p300，并检测H3K18la和POSTN水平。
评估巩膜Postn过表达对正常屈光发育的影响
验证巩膜Postn过表达是否足以诱导近视。
通过球后Tenon囊注射AAV8-POSTN，检测屈光参数、巩膜α-SMA和COL1α1水平。
评估巩膜Postn敲低对FDM发展的影响
验证降低巩膜Postn水平是否能抑制FDM。
注射AAV8-shRNA-POSTN后诱导FDM 2周，检测屈光参数和巩膜α-SMA及COL1α1水平。
验证POSTN对HSFs FMT的体外作用
确认POSTN是否直接促进人巩膜成纤维细胞FMT。
在HSFs中过表达POSTN mRNA或敲低POSTN，或用rhPOSTN处理，检测α-SMA和COL1α1水平。
探究Postn与整合素的结合及AKT信号激活
确定Postn是否通过结合特定整合素激活AKT信号。
通过免疫共沉淀检测POSTN与整合素αv、β3、β5的相互作用，通过免疫印迹检测AKT磷酸化水平。
体内验证Postn整合素AKT轴
确认在FDM小鼠巩膜中Postn与整合素结合并激活AKT。
在FDM小鼠、Postn过表达或敲低小鼠中，通过免疫共沉淀和免疫印迹检测Postn与整合素αv、β3、β5的相互作用及p-AKT水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
基因表达与表观遗传分析
基因功能调控
统计分析
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物饲养 | 小鼠饲料 | Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd | 1010058 |
| RNA提取 | RNeasy纤维组织迷你试剂盒 | Qiagen | 74704 |
| RQ1无RNA酶DNA酶 | Promega | -- | |
| 逆转录 | M-MLV逆转录酶 | Promega | -- |
| qPCR | ChamQ SYBR color qPCR预混液 | Vazyme | -- |
| ABI ViiA 7实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 组织处理 | 混合研磨仪MM 400 | Retsch | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11995 |
| 细胞消化 | I型胶原酶 | Sigma-Aldrich | C0130 |
| IV型胶原酶 | Gibco | 17104 | |
| 胰蛋白酶 | Gibco | 25200 | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 40微米细胞过滤器 | BD Biosciences | -- | |
| CUT&Tag | Hyperactive通用CUT&Tag检测试剂盒 | Vazyme | TD903 |
| 抗H3K18la抗体 | PTM Bio | PTM-1406 | |
| 山羊抗兔IgG H&L | Vazyme | AB206-01-AA | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 12430 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10099 | |
| GlutaMAX补充剂 | Gibco | 35050079 | |
| Mycoblue支原体检测试剂盒 | Vazyme | D101-01 | |
| 低氧培养 | Coy体外低氧培养箱系统 | Coy Laboratory Products | -- |
| 细胞转染 | Lipofectamine RNAiMAX转染试剂 | Invitrogen | -- |
| CALNP转染试剂 | D-Nano Therapeutics | DN002-10 | |
| 蛋白处理 | 重组人POSTN蛋白 | MCE | HY-P77818 |
| 抗整合素αvβ5中和抗体 | Merck/Millipore | MAB1961 | |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | -- | |
| 蛋白定量 | 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| 免疫印迹 | 硝酸纤维素膜 | Millipore | -- |
| 免疫印迹显影 | FluorChem E成像系统 | ProteinSimple | -- |
| 免疫沉淀 | NP-40裂解液 | Beyotime Biotechnology | -- |
| Protein A/G琼脂糖珠 | Beyotime Biotechnology | -- | |
| 数据统计 | GraphPad Prism软件 | GraphPad Software | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型（FDM） | 小鼠品系、性别、年龄，弥散镜片透光率、遮盖时间 阅读提示：Methods: Form Deprivation Myopia in Mice |
| AAV注射 | 病毒注射剂量（5 µL，滴度5×10^12-1×10^13基因组拷贝/mL），注射部位（sub-Tenon's capsule） 阅读提示：Methods: Scleral Genetic Modification of Mice and Experimental Paradigms, Sub-Tenon's Capsule Injection |
| 细胞培养与处理 | HSFs来源，培养基成分，缺氧条件（1% O2），乳酸浓度（2.5, 10, 20 mM），处理时间（48小时） 阅读提示：Methods: Experiments in Cultured Human Scleral Fibroblasts |
| siRNA敲低 | siRNA序列，浓度（30 nM），转染试剂（Lipofectamine RNAiMAX） 阅读提示：Methods: Experiments in Cultured Human Scleral Fibroblasts |
| 蛋白检测 | 一抗、二抗信息（见补充表S2），蛋白上样量、凝胶浓度（10% SDS-PAGE） 阅读提示：Methods: Immunoblot Analysis, Supplementary Table S2 |