废水样本采集和核酸提取
从大阪府四个污水处理厂采集废水样本，提取核酸，为后续qPCR检测提供模板。
每周从四个污水处理厂（站点A-D）采集1 L进水废水，通过抓取采样获得。样本在4°C下运输，24小时内处理。取40 mL等分试样，12,000×g离心30分钟，沉淀重悬于600 µL进水中，使用InnuPure C16 touch系统及InnuPREP Virus DNA/RNA Kit-IPC16提取DNA和RNA。
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通过废水监测日本大阪的百日咳博德特菌和副百日咳博德特菌相关DNA浓度早期检测百日咳相关活动
Early detection of pertussis related activity by wastewater surveillance of Bordetella pertussis- and Bordetella parapertussis- associated DNA concentrations in Osaka, Japan
实验完整度
中研究包含废水样本采集、qPCR检测、加标回收实验、阈值事件检测和互相关分析，但未涉及动物模型或细胞功能验证，属于环境监测和数据分析。
主要模型
废水样本（来自大阪府四个污水处理厂） 培养的百日咳博德特菌株18323（用于加标实验）
重点核对
每周采集四个污水处理厂（站点A-D）的1 L进水废水样本 使用靶向IS481和IS1001的多重定量PCR检测 预扩增步骤后qPCR，Ct值≤29判定为阳性 基线阈值设定为基线平均值加2个标准差（μ+2σ），连续4周超过阈值定义为持续增加起点 互相关分析使用z标准化数据，滞后范围为-20至+20周
摘要
百日咳在全球范围内引起反复暴发。临床监测可能受到就医行为、诊断实践、检测敏感性和报告延迟的影响。本研究通过定量百日咳博德特菌相关IS481和IS1001 DNA浓度，评估了废水监测（WWS）的效用。2023年4月至2025年7月期间，每周从日本大阪府的四个污水处理厂采集废水样本，并使用定量PCR测量IS481和IS1001相关DNA浓度。推定的百日咳博德特菌相关IS481 DNA浓度从2024年起显著增加。基于阈值的事件检测和互相关分析均表明，废水IS481 DNA浓度比报告病例提前1至数月。相比之下，副百日咳博德特菌相关IS1001 DNA浓度在2023年出现短暂峰值，与同期临床报告一致，此后保持在较低水平。这些发现表明，WWS可能比临床报告更早检测到百日咳相关活动的增加，并强调WWS作为临床监测补充工具监测呼吸道传染病的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 废水监测能否通过定量Bordetella相关IS481和IS1001 DNA浓度来监测百日咳相关活动，并比临床报告更早检测到活动增加？
- 核心机制
- 废水中的IS481 DNA浓度可反映社区层面的百日咳相关活动，其增加可能先于临床报告，可能归因于未报告、无症状或轻症状感染、就医行为、检测实践和报告延迟。
- 主要证据
- 在2023年4月至2025年7月期间，每周从大阪府四个污水处理厂采集废水样本，使用qPCR测量IS481和IS1001 DNA浓度。阈值事件检测显示废水IS481 DNA浓度比报告病例提前15周（敏感性分析范围为4-16周），互相关分析显示最大正相关滞后期为10周。
- 研究意义
- 该研究表明废水监测可作为临床监测的补充工具，用于更早识别社区层面百日咳相关活动的变化，并有助于指导公共卫生准备，如风险沟通、加强感染预防措施和医疗资源准备。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
IS481和IS1001 DNA浓度的多重定量PCR检测
定量废水中Bordetella相关的IS481和IS1001 DNA浓度，以评估百日咳相关活动。
提取的核酸使用多重qPCR分析，靶向插入序列IS481和IS1001。qPCR在Biomark HD系统上进行，使用192.24 Dynamic Array IFC板、Preamp Master Mix和TaqMan Fast Advanced Master Mix。因目标DNA可能在废水中浓度较低，qPCR在预扩增步骤后进行，使用5 µL提取的核酸。每个样本进行重复分析，以无核酸酶水作为阴性对照。Ct值≤29的样本判定为阳性。
废水基质效应评估（加标实验）
评估废水基质对IS481检测的抑制效应，验证检测方法在废水样本中的可靠性。
使用培养的百日咳博德特菌株18323进行加标实验。菌株在含1%甘油、20%脱纤维马血和头孢布坦的Bordet-Gengou琼脂上培养，然后悬浮于Stainer-Scholte培养基中。基于650 nm光密度估算菌落形成单位（CFU），公式为1.0 OD650 = 3.0 × 10^9 CFU/mL。将系列稀释的培养菌液加标到废水样本中，并采用与研究样本相同的流程处理。核酸提取使用InnuPure C16 touch系统和InnuPREP Virus DNA/RNA Kit-IPC16；预扩增使用KOD plus ver.2 DNA聚合酶，在Applied Biosystems™ ProFlex™ PCR System上进行；预扩增产物使用AMPure XP beads纯化；qPCR使用One Step PrimeScript™ III RT-qPCR Mix, with UNG，在QuantStudio® 5 Real-Time PCR System上进行。
时间序列数据分析
评估废水IS481 DNA浓度与报告病例之间的时间关系，确定废水信号是否提前于临床报告。
将IS481和IS1001 DNA浓度转换为每升废水的目标拷贝估计值。使用4周移动平均数据。阈值事件检测：将2022年1月至2023年12月作为报告病例的低活动基线，2023年10月至12月作为废水IS481 DNA浓度的固定流行前基线。计算基线平均值（μ）和标准差（σ），阈值设为μ+2σ，将连续至少4周超过阈值的首周定义为持续增加起点。敏感性分析改变阈值（μ+1.5σ、+2.0σ、+2.5σ）和连续周数（2-5周）。互相关分析：计算滞后-20至+20周的互相关函数，对每个滞后，对时间序列进行z标准化并计算Pearson相关系数。正滞后表示DNA趋势领先于报告病例。使用2周、3周和4周移动平均进行敏感性分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 核酸提取 | InnuPure C16 touch系统 | Analytik Jena | -- |
| InnuPREP病毒DNA/RNA试剂盒-IPC16 | Analytik Jena | -- | |
| 定量PCR | Biomark HD系统 | Standard BioTools | -- |
| 192.24 Dynamic Array IFC板 | Standard BioTools | -- | |
| 预扩增预混液 | Standard BioTools | -- | |
| TaqMan Fast Advanced预混液 | Standard BioTools | -- | |
| 预扩增 | KOD plus ver.2 DNA聚合酶 | TOYOBO | KOD-211 |
| Applied Biosystems™ ProFlex™ PCR系统 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| 预扩增产物纯化 | AMPure XP磁珠 | Beckman Coulter | -- |
| 定量PCR | One Step PrimeScript™ III RT-qPCR预混液（含UNG） | Takara Bio | RR601A |
| QuantStudio® 5实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 细菌培养 | Bordet-Gengou琼脂 | -- | -- |
| Stainer-Scholte培养基 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 废水样本采集 | 采样站点（大阪府四个污水处理厂）、采样频率（每周）、采样体积（1 L进水）、采样方式（抓取采样）、运输温度（4°C）、处理时限（24小时内） 阅读提示：Materials and methods: Wastewater sample collection and nucleic acid extraction |
| 核酸提取 | 使用InnuPure C16 touch系统及InnuPREP Virus DNA/RNA Kit-IPC16（Analytik Jena）提取核酸；样本处理：40 mL等分试样，12,000×g离心30分钟，沉淀重悬于600 µL进水中 阅读提示：Materials and methods: Wastewater sample collection and nucleic acid extraction |
| qPCR检测 | 多重qPCR靶向IS481和IS1001；使用Biomark HD系统及192.24 Dynamic Array IFC板；预扩增步骤使用5 µL提取核酸；预扩增试剂为Preamp Master Mix和TaqMan Fast Advanced Master Mix（Standard BioTools）；样本重复两次；阴性对照为无核酸酶水；阳性判定Ct≤29 阅读提示：Materials and methods: Measurement of IS481- and IS1001-associated Bordetella DNA concentrations using multiplex quantitative PCR |
| 阈值事件检测 | 基线定义：报告病例低活动期为2022年1月至2023年12月；废水IS481 DNA浓度低活动期为2023年10月至12月；阈值设定为基线平均值加2个标准差；持续增加定义为连续至少4周超过阈值；敏感性分析包括阈值μ+1.5σ、+2.0σ、+2.5σ和连续周数2-5周 阅读提示：Materials and methods: Threshold-based detection of increases in wastewater DNA concentration and reported cases; Results: Temporal relationship between the wastewater IS481 DNA concentration and reported cases |
| 互相关分析 | 计算滞后期从-20至+20周的互相关函数；对每个滞后期进行z标准化并计算Pearson相关系数；使用2周、3周和4周移动平均进行敏感性分析 阅读提示：Materials and methods: Cross-correlation analysis |