Virtual screening of GPR37L1 small-molecule modulator for neuropathic pain
包含虚拟筛选、分子动力学模拟、体外细胞功能实验（如铊离子流入、BRET、钾离子测定）、体内动物模型（CIPN和SNI）以及基因敲除验证等独立证据层级，并包含功能验证和机制验证。
HEK293细胞（表达GPR37L1） 小鼠原代卫星胶质细胞（SGC） 人原代卫星胶质细胞（SGC） 小鼠神经病理性疼痛模型（CIPN和SNI）
P06剂量（3.6 μg鞘内注射） GPR37L1依赖（使用Gpr37l1敲除小鼠） 给药方式（鞘内注射） 疼痛行为检测（von Frey机械刺激、丙酮冷刺激） 检测时间点（1小时至24小时）
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
从大型化合物库中鉴定与GPR37L1高亲和力结合的小分子候选物，并预测其结合模式的稳定性。
使用Mcule数据库的1000万化合物，基于MaR1结构进行相似性搜索，获得约10万化合物；进行分子对接、KDEEP深度学习结合亲和力预测和MD模拟，筛选出5个候选物，其中P06（Mcule-2884027413）具有最低结合自由能（-9.94 kcal/mol）。对P06进行1000 ns MD模拟稳定性评估，并进行GLU210和GLU375丙氨酸突变的模拟。
验证P06是否激活GPR37L1并调节下游离子通道功能。
在表达GPR37L1的HEK293细胞中进行BRET实验检测G蛋白激活，进行铊离子流入实验检测钾通道活性；在小鼠和人原代SGC培养中检测细胞因子释放和钾离子水平。
评估P06在神经病理性疼痛小鼠模型中的镇痛效果及其剂量依赖性和GPR37L1依赖性。
建立CIPN（紫杉醇腹腔注射）和SNI模型，鞘内给予P06，通过von Frey纤维和丙酮实验检测机械和冷异常性疼痛；使用野生型、杂合子和敲除小鼠验证GPR37L1依赖性；进行开放场和转棒实验评估运动功能；进行条件位置偏爱实验评估自发痛。
探究P06调节SGCs功能和神经炎症的机制。
使用免疫组化检测DRG中GFAP和Iba1表达；在人和小鼠SGC培养中检测IL-1β释放和钾离子水平；通过单细胞RNA测序数据meta分析验证GPR37L1和KCNJ3在SGC中的共表达。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 虚拟筛选 | Mcule数据库 | -- | -- |
| InfiniSee | BioSolveIT GmbH | -- | |
| Schrodinger套件2019-4 | Schrodinger | -- | |
| ChemPlot | -- | -- | |
| 计算模拟 | GPCR-ModSim | -- | -- |
| Chai-1 | -- | -- | |
| Autodock 4 | -- | -- | |
| KDEEP | -- | -- | |
| DESMOND | -- | -- | |
| 药物处理 | 紫杉醇 | Sigma-Aldrich | T7402 |
| Maresin 1 | Cayman Chemical | 10878 | |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| TrypLE Express试剂 | Gibco | 12604013 | |
| 胶原酶/分散酶 | Roche Diagnostics | -- | |
| 含GlutaMAX的DMEM/F12培养基 | ThermoFisher | -- | |
| 细胞转染 | Lonza 4D核转染仪 | Lonza | -- |
| BRET实验 | Fluorofurimazine | Selleckchem | E1620 |
| 钾离子测定 | IPG-1 AM染料 | Ion Bioscience | 3041F |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10003 |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10007 | |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Proteintech | KE10002 | |
| 免疫组化 | 抗Iba1抗体 | Wako | 019-19741 |
| 抗GFAP抗体 | MilliporeSigma | G3893 | |
| Alexa Fluor 488偶联抗兔二抗 | Invitrogen | -- | |
| Alexa Fluor 555偶联抗小鼠二抗 | Invitrogen | -- | |
| 成像 | Zeiss LSM 780共聚焦显微镜 | Zeiss | -- |
| 细胞功能检测 | Tecan Infinite M200 Pro酶标仪 | Tecan | -- |
| 行为学检测 | von Frey纤维丝 | Stoelting | -- |
| ANY-Maze软件 | Stoelting | -- | |
| 条件位置偏爱箱 | Med Associates | -- | |
| 转棒仪 | IITC Life Science | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 虚拟筛选 | 数据库版本、相似性搜索参数、对接和模拟条件 阅读提示：Methods 2.1和2.2 |
| 动物实验 | 小鼠品系、年龄、性别、饲养条件、CIPN模型建立（PTX剂量和注射频率）、SNI手术细节、鞘内给药剂量和体积 阅读提示：Methods 2.4 |
| 行为学测试 | von Frey纤维型号、测试方法、丙酮测试方法、设备型号 阅读提示：Methods 2.5和2.6 |
| 细胞实验 | 细胞系和培养条件、转染方法、P06和MaR1浓度、检测方法（BRET、铊流入、ELISA、钾测定） 阅读提示：Methods 2.9-2.13 |
| 免疫组化 | 抗体稀释度、组织处理、图像采集和定量分析参数 阅读提示：Methods 2.7 |
