构建并验证atoh7:iCre转基因谱系示踪系统
生成能永久标记atoh7谱系的转基因斑马鱼，并验证其表达模式与内源性atoh7一致。
构建atoh7:iCre;ubi:Switch转基因斑马鱼，通过活体成像和免疫组化检测mCherry表达，与atoh7:nd2GFP比较，并验证三个独立品系的标记效率。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
谱系示踪揭示斑马鱼视网膜中atoh7阳性和阴性视网膜神经节细胞群体
Lineage Tracing Reveals atoh7-Positive and Negative Retinal Ganglion Cell Populations in the Zebrafish Retina
实验完整度
高包含转基因谱系示踪系统验证、体内成像、免疫组化、突变体分析等多个独立证据层级，并有明确的功能验证和机制探讨。
主要模型
atoh7:iCre;ubi:Switch转基因斑马鱼 atoh7突变体（lakritz）斑马鱼 野生型斑马鱼
重点核对
转基因斑马鱼构建：atoh7:iCre与ubi:Switch报告基因配对，F2代验证单插入和表达模式一致性 atoh7谱系标记验证：通过活体成像和免疫组化确认mCherry表达与内源性atoh7时空模式一致 RGC定量分析：Rbpms2标记RGC，统计mCherry+和mCherry-比例，5 dpf和3 mpf各n=5和n=3 突变体分析：atoh7突变体中RGC标记Rbpms2和pou4f2缺失验证
摘要
目的：Atoh7是一种短暂表达的发育转录因子，有助于所有七种主要视网膜细胞类型的生成。尽管具有广泛的谱系潜能，Atoh7特异性地为视网膜神经节细胞（RGC）的形成和存活所必需。在小鼠中，相当比例的RGC来自Atoh7阴性祖细胞，提示Atoh7在RGC发育中可能具有非自主作用。尽管atoh7功能在斑马鱼中是保守的，但完整的谱系，包括对RGC群体的贡献，尚未完全确定。在此，我们试图确定野生型和atoh7突变体斑马鱼中atoh7视网膜谱系。方法：我们生成了atoh7:iCre转基因斑马鱼，并将其与已建立的ubi:Switch报告基因配对，以永久标记atoh7谱系。我们使用体内实时成像和免疫组织化学在胚胎、幼年和成体视网膜以及成体大脑的特定区域验证了转基因表达和谱系标记。结果：atoh7:iCre;ubi:Switch系统准确重现了内源性atoh7的起始表达，报告基因表达持续到成年。我们发现野生型视网膜中79%的RGC来自atoh7阳性祖细胞，这一比例高于先前在小鼠中报道的比例。此外，突变体视网膜显示atoh7谱系+/Pax6+无长突细胞显著增加，Prox1+双极细胞数量增加。我们还鉴定了其他中枢神经系统（CNS）区域中的atoh7谱系阳性细胞。结论：我们的发现揭示了斑马鱼中包括RGC在内的atoh7谱系阳性和阴性视网膜细胞类型，为研究视网膜发育过程中atoh7谱系阴性RGC的存活和细胞命运机制提供了平台。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 斑马鱼视网膜中atoh7谱系是否包含阳性和阴性RGC群体，以及各主要视网膜细胞类型在atoh7谱系中的占比如何？
- 核心机制
- atoh7阳性和阴性祖细胞共同产生RGC，atoh7对RGC的生成和存活至关重要，其缺失导致RGC完全丧失，并影响无长突细胞和双极细胞的命运比例。
- 主要证据
- atoh7:iCre;ubi:Switch谱系示踪显示79%的RGC来源于atoh7阳性谱系，21%为阴性；atoh7突变体中RGC标记缺失，且Pax6+无长突细胞中atoh7谱系比例增加，双极细胞总数增加。
- 研究意义
- 提供了研究atoh7谱系阴性RGC的生成和存活机制的平台，为理解视网膜发育中非自主作用提供基础。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
定量分析野生型视网膜中atoh7谱系RGC比例
确定野生型斑马鱼视网膜中atoh7阳性RGC的比例。
利用Rbpms2标记RGC，统计mCherry+和mCherry-细胞比例，在5 dpf和3 mpf进行分析。
比较野生型和atoh7突变体中各主要视网膜细胞类型的atoh7谱系比例
评估atoh7缺失对各细胞类型atoh7谱系比例的影响。
在5 dpf野生型和atoh7突变体视网膜中，使用标记物（Pax6、Prox1、Rbpms2、WGA、Zpr1）鉴定无长突细胞、双极细胞、神经节细胞、缪勒胶质细胞、水平细胞和光感受器，统计mCherry+和mCherry-比例。
检测atoh7突变体中RGC标记的缺失
验证atoh7突变体中RGC是否缺失。
通过免疫组化检测Rbpms2和RNA原位杂交检测pou4f2在36 hpf和48 hpf的表达。
鉴定中枢神经系统中atoh7谱系细胞
探索atoh7谱系在视网膜以外的CNS区域的分布。
对3 mpf成体大脑进行清除、免疫染色和共聚焦成像，观察mCherry+细胞分布。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 斑马鱼饲养 | InstantOcean海盐 | InstantOcean | -- |
| 斑马鱼麻醉 | 三卡因 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. | -- |
| 转基因构建 | Tol2转座酶mRNA | -- | -- |
| 免疫组织化学 | OCT包埋剂 | Thermo Scientific | -- |
| mCherry抗体 | OriGene | AB0081-500 | |
| Rbpms2抗体 | Abcam | AB181098-1001 | |
| Cre抗体 | Millipore | MAB3120 | |
| Pax6抗体 | Proteintech | 12323-1-AP | |
| Prox1抗体 | Millipore | AB5475 | |
| Zpr1抗体 | Zirc | ANZPR-1 | |
| 小麦胚芽凝集素偶联Alexa 488 | ThermoFisher | W11261 | |
| DAPI | -- | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | Southern Biotech | -- | |
| 组织透明化 | OPTIClear透明化溶液 | -- | -- |
| SDS | -- | -- | |
| 18孔盖玻片系统 | Cellvis | C18-1.5H | |
| 显微镜 | 蔡司AxioImagerZ.2显微镜 | Zeiss | -- |
| 尼康激光共聚焦显微镜 | Nikon | -- | |
| Andor BC43 | Andor, Oxford Instruments | -- | |
| Dragonfly 620SR | Andor, Oxford Instruments | -- | |
| 徕卡DMi8显微镜 | Leica | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 斑马鱼饲养 | 水温28°C，14小时光照/10小时黑暗循环，胚胎在1xIO海盐(0.06 g/L)中培养，24 hpf后加入0.003% PTU抑制色素。 阅读提示：Methods: Zebrafish Husbandry |
| 转基因谱系示踪 | atoh7:iCre与ubi:Switch配对，注射Tol2转座酶mRNA和质粒各50 pg，F2代验证。 阅读提示：Methods: Plasmid and Transgenic Line Generation |
| 免疫荧光定量 | 视网膜切片厚度10 µm，抗体稀释度，细胞计数使用整个视网膜切片，5 dpf n=5，3 mpf n=3。 阅读提示：Methods: Immunohistochemistry, Results and Figure legends |
| atoh7突变体分析 | atoh7突变体（lakritz）菌株，RGC标记Rbpms2和pou4f2缺失验证，细胞类型标记定量。 阅读提示：Results: The Zebrafish atoh7 Lineage Represents all Major Retinal Cell Types, Except Müller Glia |