胚胎获取与体外培养
建立B6和BTBR小鼠胚胎体外培养模型，比较品系间脂滴动态。
超促排卵后从输卵管/子宫冲出胚胎，在KSOM培养基中培养至囊胚阶段，部分用于体内对照。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
小鼠囊胚中脂滴代谢的品系和谱系特异性调控
Strain- and lineage-specific regulation of lipid droplet metabolism in the mouse blastocyst†
实验完整度
高研究包含多种实验层级：体内外胚胎培养、药物抑制（CQ、DEUP、etomoxir、L-carnitine）、脂滴去除实验、谱系特异性定量分析，并进行了功能验证。
主要模型
BTBR T+ Itpr3tf/J (BTBR) 小鼠胚胎 C57BL/6J (B6) 小鼠胚胎
重点核对
BTBR和B6品系的小鼠胚胎（体内和体外培养） 药物处理条件：氯喹（50 μM）、DEUP（100 μM）、依托莫昔（25 μM或100 μM）、L-肉碱（0.3 μg/mL或3 μg/mL） 培养条件：KSOM培养基（含或不含脂肪酸） 脂滴定量：体积、数量、大小分布（0.01-0.1, 0.1-0.5, 0.5-5, 5-30, >30 μm³） 统计方法：双因素方差分析、事后检验（Tukey或Bonferroni）
摘要
脂滴（LDs）是多功能细胞器，作为脂肪酸的储存库，并在哺乳动物着床前发育过程中作为β-氧化和ATP合成的底物。然而，其生物发生和利用的遗传及谱系特异性调控仍知之甚少。在此，我们报道了一个胚胎LD缺陷的小鼠模型，即BTBR T+ Itpr3tf/J近交品系，其特征是合子中缺乏卵母细胞遗传的LD簇，并且在桑葚胚到囊胚转变阶段，新生成的LDs迅速耗尽，与C57BL/6J对照相比。谱系分辨分析揭示了滋养外胚层中大LDs的选择性耗尽，而内细胞团中脂质持续积累，表明脂质利用具有谱系特异性。药理学抑制自噬或胞质脂肪酶活性可特异性地在BTBR胚胎中引起LD积累和发育停滞，表明对脂质动员的必需依赖性。通过依托莫昔抑制和左卡尼汀刺激调节线粒体脂肪酸β-氧化，以品系特异性方式改变了脂滴增大和谱系间的分配，并改变了外胚层细胞数量，将脂质分解代谢与谱系适应性联系起来。这些发现确定了一个遗传编码的、谱系特异性的LD程序，将脂质动员与囊胚形态发生、胚胎存活和谱系稳态联系起来。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 脂滴代谢在着床前胚胎发育过程中是否存在品系和谱系特异性的调控机制？
- 核心机制
- BTBR胚胎通过增强的脂质动员（包括自噬和脂肪分解）和脂肪酸β-氧化，特别是在滋养外胚层中，导致脂滴缺乏，而内细胞团保留脂滴，从而影响谱系适应性和发育。
- 主要证据
- 与B6相比，BTBR胚胎在囊胚阶段总LD体积减少，TE中>30 μm³的大LD数量减少；抑制自噬或脂肪分解导致BTBR胚胎发育停滞；调节β-氧化改变LD分布和细胞数。
- 研究意义
- 研究揭示了基因型驱动的谱系特异性脂滴程序，对辅助生殖技术中代谢干预和培养基补充剂有潜在影响。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
脂滴染色与共聚焦成像
可视化并定量分析脂滴在发育过程中的动态变化。
使用BODIPY 493/503染色脂滴，免疫荧光标记CDX2（TE）和SOX2（ICM），共聚焦显微镜成像，Imaris软件进行3D重建和定量。
脂滴去除实验
验证初始脂滴储备是否影响后续脂滴动态。
通过两步离心法去除B6合子的脂滴，然后培养至囊胚阶段，比较LD参数。
药理学抑制自噬和脂肪分解
评估自噬和脂肪分解在胚胎发育中的作用。
用氯喹（CQ）抑制自噬，DEUP抑制脂肪酶，观察发育率和脂滴变化。
调节脂肪酸β-氧化
研究β-氧化对脂滴分布和细胞数的影响。
用依托莫昔抑制β-氧化，L-肉碱刺激β-氧化，分析囊胚中LD分布和细胞数量。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 胚胎培养 | 胚胎最大钾简化优化培养基 | Sigma-Aldrich | MR-121-D |
| 矿物油 | Sigma-Aldrich | M8410 | |
| 氯喹 | Sigma-Aldrich | C6628 | |
| DEUP | Sigma-Aldrich | D7692 | |
| 依托莫昔 | MedChemExpress | HY-50202 | |
| L-肉碱 | Sigma-Aldrich | C0158 | |
| 胚胎收集 | 孕马血清促性腺激素 | BioVendor | RP17827225000 |
| 人绒毛膜促性腺激素 | MSD Animal Health | 018533 | |
| 透明质酸酶 | Sigma-Aldrich | H-3506 | |
| 脂质去除 | 细胞松弛素B | Sigma-Aldrich | C2743 |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S9378 | |
| 免疫荧光 | SOX2抗体 | R&D Systems | AF2018 |
| CDX2抗体 | BioGenex | MU392A-UC | |
| 抗线粒体融合素2抗体 | Abcam | ab56889 | |
| Hoechst 33342 | Sigma-Aldrich | H6024 | |
| 脂滴染色 | BODIPY 493/503 | Thermo Fisher Scientific | D3922 |
| 活细胞染色 | BioTracker双色线粒体-溶酶体活细胞染料 | Sigma-Aldrich | SCT244 |
| 共聚焦成像 | 尼康A1R激光扫描共聚焦显微镜 | Nikon Instruments Inc. | -- |
| Imaris软件 | Bitplane AG | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 胚胎培养 | 培养基：KSOM（含/不含脂肪酸）；培养条件：37.5°C，5% CO₂和5% O₂；药物浓度：CQ 50 μM，DEUP 100 μM，etomoxir 25/100 μM，L-carnitine 0.3/3 μg/mL 阅读提示：Materials and methods - Embryo culture |
| 脂滴去除 | 离心参数：4200×g 10 min，9500×g 10 min；细胞松弛素B浓度：50 μg/mL 阅读提示：Materials and methods - Lipid droplet depletion via two-step centrifugation and micromanipulation |
| 免疫荧光和脂滴染色 | 抗体：anti-SOX2 (1:100), anti-CDX2 (1:100), anti-MFN2 (1:100)；BODIPY浓度：1 μg/mL；固定：4% PFA 20 min 阅读提示：Materials and methods - Immunofluorescence and BODIPY LDs staining |
| 共聚焦成像和定量 | 显微镜：Nikon A1R；软件：Imaris 9.8.2；LD体积阈值：0.01 μm³；距离分类：5 μm 阅读提示：Materials and methods - Confocal imaging and analyses |
| 统计分析 | 样本量：2-4个生物学重复；统计方法：双因素方差分析，事后检验Tukey或Bonferroni；正态性检验：Shapiro-Wilk 阅读提示：Materials and methods - Statistical analysis |