样本收集与处理
收集CD患者和对照者的粪便、尿液和血清样本，用于量化食品添加剂水平。
从澳大利亚、香港和中国大陆的487名受试者收集1461份生物样本，包括粪便、尿液和血清。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
量化克罗恩病中的人工甜味剂和乳化剂及其与疾病活动度的关系：ENIGMA研究——一种新型靶向方法
Quantifying artificial sweeteners and emulsifiers in Crohn's disease and its relationship with disease activity: the ENIGMA study - a novel and targeted approach
实验完整度
高研究包含多中心人群样本检测、体外细胞模型验证及独立验证队列，并涉及宏基因组与蛋白质组等多组学关联分析，实验层级丰富。
主要模型
Caco-2细胞单层模型 粪便微生物与P-80共培养模型 克罗恩病患者和对照者生物样本
重点核对
样本来源：澳大利亚、香港和中国大陆的CD患者和对照者的粪便、尿液和血清样本 甜味剂定量方法：LC-MS/MS，使用Hypersil GOLD C18色谱柱，流动相含0.01%甲酸，电喷雾负离子模式，监测特定离子对 P-80代谢物半定量方法：基于峰面积，对聚合度分类 体外通透性实验：Caco-2单层细胞，TEER测量，FITC-dextran渗透，处理浓度为CD_P-80 10ng/mL，甜味剂浓度等 GLM模型：区分活动性CD（CDAI≥150）与非活动性CD，使用粪便P-80代谢物和三种甜味剂水平，在发现队列和验证队列中评估
摘要
背景：食品添加剂已被认为与克罗恩病（CD）的风险和活动度增加有关，但尚未探索其在人体中的定量。目的：我们旨在测量CD患者中的人工甜味剂和乳化剂聚山梨酯-80（P-80），并评估其与疾病活动度的关联。设计：分析了来自澳大利亚、香港和中国大陆的487名受试者（245名CD患者和242名对照者）的1461份生物样本中的阿斯巴甜、三氯蔗糖、糖精和P-80在粪便、尿液和血清中的水平。CD活动度通过克罗恩病活动指数和粪便钙卫蛋白进行评估。使用P-80和甜味剂构建的广义线性模型（GLM）区分活动性CD和非活动性CD。结果：与各队列中的对照者相比，CD患者的甜味剂水平更高（均p<0.0001）。P-80在CD患者中主要发生水解和氧化还原降解，而在对照者中则发生氧化还原降解，其天然形式检测不到。CD相关的P-80代谢物与CD患者尿液中的甜味剂水平呈正相关。在体外，CD相关的P-80代谢物增加了肠道通透性，使甜味剂能够穿过上皮。在活动性CD中，甜味剂和特定的CD相关P-80代谢物水平更高。使用甜味剂和P-80代谢物构建的GLM区分了活动性CD和非活动性CD，在发现队列中曲线下面积（AUC）为0.86，在来自澳大利亚和中国大陆的两个独立验证队列中平均AUC为0.94。结论：这是第一项人体研究，证明CD患者与对照者相比存在不同的P-80代谢。膳食甜味剂和P-80代谢物与疾病活动度显示出显著相关性，提示它们作为CD活动度评估的非侵入性生物标志物的潜在用途。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 克罗恩病患者体内人工甜味剂和乳化剂聚山梨酯-80的水平是否与疾病活动度相关？
- 核心机制
- CD患者的肠道菌群改变导致P-80代谢偏向水解途径，产生增加肠道通透性的代谢物（如POE异山梨醇），这些代谢物破坏上皮屏障，促进甜味剂转运，进而与疾病活动度相关。
- 主要证据
- 多中心队列样本检测显示CD患者甜味剂和特定P-80代谢物水平升高；Caco-2细胞实验显示CD相关P-80代谢物增加通透性并降低ZO-1表达；粪便宏蛋白质组和宏基因组分析提示特定菌群变化。
- 研究意义
- 粪便P-80代谢物和人工甜味剂水平与活动性CD显著相关，有望作为支持疾病活动度评估和未来患者管理的生物标志物，并有助于理解食品添加剂在CD中的作用。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
食品添加剂定量检测
开发并应用LC-MS/MS方法定量检测生物样本中的人工甜味剂和P-80代谢物。
使用LC-MS/MS定量检测粪便、尿液和血清中的阿斯巴甜、糖精、三氯蔗糖和P-80代谢物，对P-80代谢物采用半定量峰面积分析。
P-80代谢物与菌群关联分析
探究CD患者和对照者P-80代谢差异是否由肠道菌群变化驱动。
对粪便样本进行蛋白质组学和宏基因组学分析，比较CD患者和对照者相关菌群和功能酶，并通过体外粪便与P-80共培养验证。
体外实验验证P-80代谢物对肠道屏障的影响
验证CD相关P-80代谢物是否通过破坏肠道屏障促进甜味剂转运。
使用Caco-2细胞单层模型，分别用CD相关或对照相关的P-80代谢物和甜味剂处理，测量TEER、FITC-dextran渗透和ZO-1表达。
疾病活动度关联分析
评估甜味剂和P-80代谢物水平与CD疾病活动度的相关性。
分析粪便和尿液甜味剂水平与粪便钙卫蛋白的相关性，比较活动期和非活动期患者粪便P-80代谢物水平，并在独立队列中验证。
构建GLM区分活动性疾病
评估甜味剂和P-80代谢物作为生物标志物区分活动性CD与非活动性CD的潜力。
使用香港发现队列（n=77）构建逻辑回归模型，并在两个独立验证队列（澳大利亚n=88，中国大陆n=51）中评估。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 甜味剂定量 | Hypersil GOLD C18选择性高效液相色谱柱 | Thermo Scientific | -- |
| P-80代谢物定量 | Waters ACQUITY PREMIER超高效液相色谱系统 | Waters | -- |
| Waters Xevo TQ-XS三重四极杆质谱仪 | Waters | -- | |
| 粪便培养 | P-80储备液 | -- | -- |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | -- | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | -- | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒 | TaKaRa | -- |
| qPCR | TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) | TaKaRa | -- |
| 渗透性实验 | FITC-葡聚糖（4kDa） | -- | -- |
| 免疫荧光染色 | Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG二抗 | -- | -- |
| 粪便钙卫蛋白检测 | 特异性钙卫蛋白单克隆抗体ELISA | Bühlmann Laboratories | -- |
| 数据分析 | Thermo Scientific Xcalibur软件 | Thermo Scientific | -- |
| TraceFinder软件 | Thermo Scientific | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 样本收集 | 受试者纳入/排除标准，样本类型（粪便、尿液、血清） 阅读提示：Materials and methods 中的 Study design and participants |
| 甜味剂定量 | LC-MS/MS参数，色谱柱型号，流动相，梯度洗脱程序，离子监测对 阅读提示：Materials and methods 中的 Quantification of food additives in biological samples |
| P-80代谢物定量 | UPLC-MS/MS参数，色谱柱，梯度，监测离子，聚合度分类定义 阅读提示：Materials and methods 中的 Quantification of food additives in biological samples |
| 粪便与P-80共培养 | 粪便量（100mg），P-80浓度（10μg/mL），厌氧条件，37°C，24小时 阅读提示：Materials and methods 中的 Co-cultivation of fecal samples with P-80 |
| 体外细胞实验 | Caco-2细胞密度（1×10^5 cells/500μL），Transwell规格，TEER达到约500Ω×cm²，处理浓度（CD_P-80 10ng/mL等），处理时间24小时 阅读提示：Materials and methods 中的 Cell co-culture experiments |
| GLM构建 | 发现队列（HK n=77），特征（粪便P-80代谢物和三种甜味剂），模型（逻辑回归L1惩罚），验证队列（AUS n=88，MC n=51） 阅读提示：Materials and methods 中的 Construction of GLM |