细胞活力测定
评估DSK对乳腺癌细胞活力的影响。
使用CCK-8实验检测不同浓度DSK处理24小时后MCF-10A、MDA-MB-231和BT549细胞的活力。
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脱氧紫草素通过失活PI3K/AKT/NF-κB通路抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和肿瘤免疫微环境
Deoxyshikonin inhibits the proliferation, invasion, and tumor immune microenvironment in breast cancer cells by inactivating the PI3K/AKT/NF-κB pathway.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK-8、流式、Transwell、WB、ELISA）、共培养实验、体内异种移植模型，并通过通路激活剂740 Y-P进行机制验证。
主要模型
MDA-MB-231细胞 BT549细胞 THP-1细胞 MDA-MB-231异种移植小鼠模型
重点核对
DSK浓度：0、1.25、2.5、5、10、20、40 μM（MCF-10A）及0、1.25、2.5、5、10、20 μM（MDA-MB-231和BT549），处理24小时 细胞凋亡检测：DSK浓度0、5、10、20、40 μM处理24小时 Transwell侵袭实验：细胞密度1×10^5，下室含20% FBS，培养24小时 体内实验：BALB/c裸鼠皮下注射1×10^6 MDA-MB-231细胞，DSK 20 mg/kg腹腔注射，每组5只，持续35天 机制验证：740 Y-P（10 μM）预处理，再与DSK处理
摘要
背景/目的：已有报道称脱氧紫草素（DSK）在多种癌症中抑制肿瘤生长，但其在乳腺癌（BC）中的作用和作用机制尚不清楚。本研究探讨了DSK在BC中的抗癌功能及其机制。材料/方法：采用人乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549。分别使用Cell Counting Kit-8实验和流式细胞术检测细胞活力和凋亡水平。通过Western blot分析评估凋亡相关因子（Ki-67、Bax和Bcl-2）、CD206、CD168以及参与磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）/核因子（NF）-κB通路的蛋白的表达。使用Transwell实验测定细胞侵袭能力。使用酶联免疫吸附测定法检测白细胞介素（IL）-10和转化生长因子（TGF）-β的水平。使用异种移植小鼠模型评估DSK的体内功能。结果：DSK抑制MDA-MB-231和BT549细胞的增殖、增强细胞凋亡、降低细胞侵袭。DSK还降低了佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯诱导的THP-1细胞中CD206和CD168蛋白的水平以及IL-10和TGF-β的水平。DSK下调了细胞中磷酸化（p）-PI3K、p-AKT和p-NF-κB蛋白的表达。这些效应被740 Y-P（PI3K/AKT激活剂）逆转。此外，DSK显著降低了异种移植小鼠模型中的肿瘤体积和重量。DSK增加了皮下肿瘤组织中的细胞凋亡水平，并降低了Ki-67和CD206的表达。DSK还失活了PI3K/AKT/NF-κB通路蛋白。结论：DSK通过失活PI3K/AKT/NF-κB通路抑制BC细胞的增殖、侵袭和肿瘤免疫微环境，表明DSK可能是BC治疗的潜在选择。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- DSK在乳腺癌中的抗肿瘤功能及其是否通过PI3K/AKT/NF-κB通路发挥作用的机制。
- 核心机制
- DSK通过抑制PI3K/AKT/NF-κB通路的磷酸化失活该通路，从而抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和肿瘤免疫微环境。
- 主要证据
- 体外实验显示DSK抑制MDA-MB-231和BT549细胞增殖、诱导凋亡、抑制侵袭，降低CD206、CD168、IL-10、TGF-β水平，并下调p-PI3K、p-AKT、p-NF-κB蛋白表达；740 Y-P能逆转这些效应；体内异种移植实验显示DSK减少肿瘤体积和重量，降低Ki-67和CD206表达，增加凋亡。
- 研究意义
- DSK可能成为乳腺癌治疗的潜在治疗选择，为乳腺癌治疗提供新的思路。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
细胞凋亡检测
评估DSK对乳腺癌细胞凋亡的影响。
使用Annexin-V/PI双染法和流式细胞术检测不同浓度DSK处理后MDA-MB-231和BT549细胞的凋亡率。
Western blot检测凋亡相关蛋白
评估DSK对凋亡相关蛋白表达的影响。
用Western blot检测不同浓度DSK处理后细胞中Ki-67、Bax、Bcl-2蛋白水平。
Transwell侵袭实验
评估DSK对乳腺癌细胞侵袭能力的影响。
将不同浓度DSK处理的MDA-MB-231和BT549细胞接种于Transwell上室，下室含20% FBS培养基，培养24小时后计数侵袭细胞。
共培养实验
评估DSK对肿瘤免疫微环境的影响。
将DSK处理的乳腺癌细胞上清与PMA诱导的THP-1细胞共培养，检测THP-1细胞中CD206、CD168、IL-10、TGF-β的表达。
通路蛋白检测
评估DSK对PI3K/AKT/NF-κB通路的影响。
Western blot检测不同浓度DSK处理或加740 Y-P后，MDA-MB-231和BT549细胞中p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、p-NF-κB、NF-κB的蛋白水平。
体内异种移植实验
评估DSK在体内的抗肿瘤作用。
BALB/c裸鼠皮下注射MDA-MB-231细胞构建异种移植模型，随机分为sham组和DSK组，测量肿瘤体积和重量，并检测肿瘤组织中Ki-67、CD206表达、凋亡水平及PI3K/AKT/NF-κB通路蛋白。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM/F12培养基 | Gibco | 10565-018 |
| DMEM培养基 | HyClone | SH30022.01B | |
| RPMI1640培养基 | Gibco | 31800-022 | |
| 胎牛血清 | HyClone | SH30396.03 | |
| 青霉素/链霉素 | HyClone | SV30010 | |
| 马血清 | Gibco | 16050-122 | |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I9278 | |
| 表皮生长因子 | Sigma-Aldrich | E-4127 | |
| 药物处理 | 脱氧紫草素 | ChemFaces | -- |
| 二甲基亚砜 | Sigma-Aldrich | -- | |
| 740 Y-P | MCE | HY-P0175 | |
| CCK-8实验 | CCK-8试剂 | Beyotime | C0038 |
| 流式细胞术 | Annexin-V/PI凋亡试剂盒 | Beyotime | C1062 |
| Western blot | Ki-67抗体 | Abcam | ab279653 |
| Bax抗体 | Novus Biologicals | NB100-56095 | |
| Bcl-2抗体 | Cell Signaling Technology | 15071S | |
| CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| CD168抗体 | Abcam | ab124729 | |
| p-PI3K抗体 | Abcam | ab182651 | |
| PI3K抗体 | Abcam | ab302958 | |
| p-AKT抗体 | Abcam | ab278559 | |
| AKT抗体 | Abcam | ab8805 | |
| p-NF-κB抗体 | Abcam | ab76302 | |
| NF-κB抗体 | Abcam | ab32536 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Abcam | ab8226 | |
| 二抗 | Abcam | ab205719 | |
| 二抗 | Abcam | ab6721 | |
| 增强化学发光底物 | Thermo Fisher Scientific | -- | |
| Transwell实验 | Transwell小室 | Corning | 3422 |
| 细胞分化 | 佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯 | Sigma-Aldrich | -- |
| ELISA | IL-10 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EMC005.96 |
| TGF-β ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EMC107b.96 | |
| TUNEL实验 | TUNEL试剂盒 | Absin Bioscience | abs50033 |
| 免疫组化 | Ki-67抗体 | Abcam | ab15580 |
| CD206抗体 | Abcam | ab64693 | |
| 细胞培养 | MCF-10A细胞 | ATCC | -- |
| MDA-MB-231细胞 | ATCC | -- | |
| BT549细胞 | ATCC | -- | |
| THP-1细胞 | ATCC | -- | |
| 动物实验 | BALB/c裸鼠 | Shanghai SLAC Laboratory Animals | -- |
| 细胞培养 | 蛋白酶K | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源（ATCC），培养基类型（DMEM/F12、DMEM、RPMI1640），血清浓度（10% FBS），培养条件（37°C, 5% CO2） 阅读提示：Materials and Methods: Cell culture |
| CCK-8实验 | 细胞密度，DSK浓度（0、1.25、2.5、5、10、20、40 μM），处理时间（24h），CCK-8试剂添加量（10 μL）和孵育时间（1h） 阅读提示：Materials and Methods: Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay; Fig. 1 legend |
| 细胞凋亡检测 | DSK浓度（0、5、10、20、40 μM），处理时间（24h），Annexin-V/PI试剂盒使用 阅读提示：Materials and Methods: Flow cytometry analysis for apoptosis; Fig. 1E legend |
| Western blot | 蛋白提取和定量，抗体稀释比例（如Ki-67 1:600, Bax 1:1000等），ECL显色 阅读提示：Materials and Methods: Western blot (WB); Fig. 1F, 3, 4A, 5H legends |
| Transwell侵袭实验 | 细胞密度（1×10^5），上室体积（100 μL），下室FBS浓度（20%），培养时间（24h），染色方法（0.1%结晶紫） 阅读提示：Materials and Methods: Transwell assay; Fig. 2A, 4D legend |
| 共培养实验 | PMA浓度（100 nM）处理THP-1 48小时，DSK处理浓度（0、5、10、20 μM），共培养时间（48小时） 阅读提示：Materials and Methods: Co-culture experiment; Fig. 2B, 4F legend |
| ELISA | 细胞因子IL-10和TGF-β检测，试剂盒（NeoBioscience EMC005.96和EMC107b.96） 阅读提示：Materials and Methods: Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |
| 动物实验 | 小鼠品系（BALB/c雌性裸鼠，4-6周龄），细胞注射数量（1×10^6），分组（sham和DSK组，每组5只），给药剂量（20 mg/kg DSK），给药方式（腹腔注射），实验周期（35天），肿瘤体积计算公式 阅读提示：Materials and Methods: Construction of xenograft mouse model; Fig. 5 legend |
| 免疫组化 | 固定和包埋方法，一抗稀释（Ki-67 1:1000, CD206 1:200），显色方法 阅读提示：Materials and Methods: Immunohistochemistry; Fig. 5E, F legend |
| TUNEL实验 | 组织切片处理，蛋白酶K浓度（2 mg/mL）和孵育时间（30 min），TUNEL试剂盒（abs50033）的使用 阅读提示：Materials and Methods: Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling (TUNEL); Fig. 5G legend |
| 统计分析 | 统计学方法（Student's t-test或one-way ANOVA），显著性水平（P < 0.05） 阅读提示：Materials and Methods: Statistical analysis; Figure legends |