患者纳入与分组
比较冠状动脉粥样硬化患者与正常冠状动脉者的免疫指标差异。
纳入66例经冠状动脉造影确诊的患者,分为AS组(≥50%狭窄)和NCA组(无血管疾病),收集临床特征和血液样本。
HMGB1Modulates the Treg/Th17 Ratio in Atherosclerotic Patients.
研究包含临床样本(AS与NCA患者)的横断面分析,通过流式、qRT-PCR和ELISA进行表型与分子检测,并采用相关性分析,但缺乏功能验证或机制验证。
冠状动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞 正常冠状动脉者外周血单个核细胞
患者分组:AS组(≥50%狭窄)与NCA组(无血管疾病),每组33例 PBMC分离:Ficoll–Hypaque梯度离心(1800 rpm,20分钟) Th17/Treg分析:流式细胞术表面与胞内染色 细胞培养刺激:PMA/Ionomycin混合物(4 μL/mL)和BFA/Monensin混合物(4 μL/mL)处理6小时 相关性分析:Pearson相关分析评估HMGB1与Treg/Th17比率关系
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较冠状动脉粥样硬化患者与正常冠状动脉者的免疫指标差异。
纳入66例经冠状动脉造影确诊的患者,分为AS组(≥50%狭窄)和NCA组(无血管疾病),收集临床特征和血液样本。
获取外周血单个核细胞并进行Th17细胞刺激培养。
使用Ficoll–Hypaque梯度离心从肝素抗凝血中分离PBMC,并在完全培养基中培养。
检测Treg和Th17细胞频率及Treg/Th17比率。
通过流式细胞术检测Th17细胞(CD3+CD8−IL-17+)和Treg细胞(CD4+CD25+CD127−)频率。
检测HMGB1、RORC和Foxp3的mRNA表达水平。
从PBMC中提取RNA,逆转录为cDNA,使用SYBR Green进行qRT-PCR,GAPDH作为内参。
检测血清中HMGB1、IL-10、TGF-β1、IL-17A和IL-23的浓度。
使用商业ELISA试剂盒检测血清样本中的细胞因子和HMGB1水平。
分析组间差异及HMGB1与Treg/Th17比率的相关性。
使用Student's t检验进行组间比较,Pearson相关分析评估相关性。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI 1640培养基 | Gibco | Lot 31800-022 |
| PMA/离子霉素混合物 | Liankebio | Lot LK-CS1001 | |
| BFA/莫能菌素混合物 | Liankebio | Lot LK-CS1002 | |
| 流式分析 | FITC标记的抗人CD3抗体 | eBioscience | Lot 11-0039-42 |
| APC标记的抗人CD8抗体 | eBioscience | Lot 17-0088-42 | |
| PE标记的抗人IL-17A抗体 | eBioscience | Lot 85-12-7178-42 | |
| FITC标记的抗人CD4抗体 | eBioscience | Lot 85-11-0047-42 | |
| PE标记的抗人CD25抗体 | eBioscience | Lot 85-12-0259-42 | |
| PE-CY7标记的抗人CD127抗体 | eBioscience | Lot 85-25-1278-42 | |
| 固定/破膜缓冲液 | eBioscience | Lot 88-8824 | |
| Accuri 6 BD流式细胞仪 | BD | -- | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Takara | -- |
| Prime-Script RT试剂盒 | Sigma | Lot 00171359 | |
| SYBR Premix Ex Taq | Takara | Lot AK8306 | |
| Agilent SureCycler 8800系统 | Agilent | -- | |
| GAPDH引物 | Sangon Biotech | Lot PHS04 | |
| ELISA | 人TGF-β1 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | Lot EHC107b.96 |
| 人IL-10 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | Lot EHC009.96 | |
| 人IL-17A ELISA试剂盒 | NeoBioscience | Lot EHC170.96 | |
| 人IL-23 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | Lot EHC171.96 | |
| HMGB1 ELISA试剂盒 | Westang | Lot F01020 | |
| 酶标仪 | Thermo | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者入组 | AS组:至少一条冠状动脉狭窄≥50%;NCA组:无血管疾病;样本量每组33例;排除标准包括糖尿病、近期心血管事件、感染等 阅读提示:见Materials and Methods中的Patient Population和Table 1 |
| PBMC分离 | 血液量:5-10 mL肝素抗凝血;Ficoll–Hypaque梯度离心:1800 rpm,室温20分钟;细胞密度:2×10^6个/mL 阅读提示:见Materials and Methods中的Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) |
| 流式细胞术 | Th17分析:PMA/Ionomycin刺激6小时,BFA/Monensin存在;抗体:CD3-FITC、CD8-APC、IL-17A-PE;Treg分析:CD4-FITC、CD25-PE、CD127-PE-CY7;使用Accuri 6 BD流式细胞仪 阅读提示:见Materials and Methods中的Flow Cytometry和Figure 1 legend |
| qRT-PCR | RNA提取用Trizol;逆转录使用Prime-Script RT试剂盒;PCR用SYBR Premix Ex Taq,GAPDH为内参;引物序列需验证;反应条件:95℃ 15秒,60℃ 30秒,40个循环 阅读提示:见Materials and Methods中的qRT-PCR |
| ELISA | 检测血清TGF-β1、IL-10、IL-17A、IL-23、HMGB1;所有样本重复三次;检测波长450nm;灵敏度:TGF-β1 15 pg/mL, IL-10 1 pg/mL, IL-17A 8 pg/mL, IL-23 15 pg/mL, HMGB1 0.3 ng/mL 阅读提示:见Materials and Methods中的Cytokines in Serum Determined by ELISA |
| 统计分析 | 连续变量以均值±标准差表示;组间比较用Student's t检验;相关性用Pearson相关系数;显著性水平P < 0.05 阅读提示:见Materials and Methods中的Statistical Analysis |