HMGB1调节动脉粥样硬化患者Treg/Th17比率

HMGB1Modulates the Treg/Th17 Ratio in Atherosclerotic Patients.

作者信息Jia-Wang Ding, Xia-Xia Zheng, Tian Zhou, Xiao-Hong Tong, Cai-Yun Luo, Xin-An Wang
PMID26830200
发布时间2016-06
DOI10.5551/jat.31088

实验完整度

研究包含临床样本(AS与NCA患者)的横断面分析,通过流式、qRT-PCR和ELISA进行表型与分子检测,并采用相关性分析,但缺乏功能验证或机制验证。

主要模型

冠状动脉粥样硬化患者外周血单个核细胞 正常冠状动脉者外周血单个核细胞

重点核对

患者分组:AS组(≥50%狭窄)与NCA组(无血管疾病),每组33例 PBMC分离:Ficoll–Hypaque梯度离心(1800 rpm,20分钟) Th17/Treg分析:流式细胞术表面与胞内染色 细胞培养刺激:PMA/Ionomycin混合物(4 μL/mL)和BFA/Monensin混合物(4 μL/mL)处理6小时 相关性分析:Pearson相关分析评估HMGB1与Treg/Th17比率关系

摘要

目的:动脉粥样硬化(AS)是一种以慢性炎症为特征的疾病。多种免疫细胞和炎症细胞因子,如高迁移率族蛋白(HMGB1)、调节性T(Treg)细胞、辅助性T(Th17)细胞以及炎症相关细胞因子,在其病理生理过程中发挥关键作用。大量研究报告HMGB1和Th17细胞可能促进动脉粥样硬化进展,而Treg细胞可能在动脉粥样硬化中起保护作用;因此,动脉粥样硬化疾病中可能存在Treg/Th17比率的改变。迄今为止,HMGB1水平与Treg/Th17比率之间的关系仍不完全清楚。本研究的主要目的是探讨冠状动脉粥样硬化斑块患者HMGB1水平与Treg/Th17比率之间的关系。方法:我们纳入冠状动脉粥样硬化患者和正常冠状动脉者作为研究对象。使用流式细胞术分析Treg细胞、Th17细胞频率和Treg/Th17比率。此外,采用实时聚合酶链反应检测HMGB1、维甲酸相关孤儿核受体C(RORC)和叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)的mRNA表达。此外,采用酶联免疫吸附试验检测HMGB1、IL-10、TGF-β1、IL-17A和IL-23等蛋白质和细胞因子水平。结果:通过流式细胞术,我们观察到动脉粥样硬化患者Th17细胞频率显著增加,而Treg细胞频率显著降低。一致地,与正常冠状动脉(NCA)组相比,冠状动脉粥样硬化(AS)组RORC mRNA水平显著升高(P < 0.01)。相反,AS组Foxp3 mRNA表达显著低于NCA组(P < 0.01)。此外,我们观察到AS组血清HMGB1、IL-17A和IL-23浓度显著高于NCA组(分别P < 0.01),而AS组血清IL-10和TGF-β1浓度显著低于NCA组(分别P < 0.01)。另外,我们还发现两组的HMGB1水平与Treg/Th17比率呈负相关(r = −0.6984, P < 0.01)。结论:我们的研究数据表明,HMGB1可能通过调节Treg/Th17比率失衡促进动脉粥样硬化进展。关键词:AS,HMGB1,Treg细胞,Th17细胞

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
探讨冠状动脉粥样硬化斑块患者HMGB1水平与Treg/Th17比率之间的关系。
核心机制
HMGB1可能通过调节Treg/Th17比率失衡促进动脉粥样硬化进展。
主要证据
临床横断面研究显示,AS患者较NCA患者Th17细胞频率、RORC mRNA、HMGB1、IL-17A和IL-23水平升高,Treg细胞频率、Foxp3 mRNA、IL-10和TGF-β1水平降低;HMGB1与Treg/Th17比率呈负相关(r = −0.6984, P < 0.01)。
研究意义
研究提示Treg/Th17比率失衡可能是动脉粥样硬化的新发病机制,HMGB1可能成为动脉粥样硬化诊治的新靶点。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

患者纳入与分组

比较冠状动脉粥样硬化患者与正常冠状动脉者的免疫指标差异。

纳入66例经冠状动脉造影确诊的患者,分为AS组(≥50%狭窄)和NCA组(无血管疾病),收集临床特征和血液样本。

2

PBMC分离与细胞培养

获取外周血单个核细胞并进行Th17细胞刺激培养。

使用Ficoll–Hypaque梯度离心从肝素抗凝血中分离PBMC,并在完全培养基中培养。

3

流式细胞术检测Treg和Th17细胞频率

检测Treg和Th17细胞频率及Treg/Th17比率。

通过流式细胞术检测Th17细胞(CD3+CD8−IL-17+)和Treg细胞(CD4+CD25+CD127−)频率。

4

qRT-PCR检测基因表达

检测HMGB1、RORC和Foxp3的mRNA表达水平。

从PBMC中提取RNA,逆转录为cDNA,使用SYBR Green进行qRT-PCR,GAPDH作为内参。

5

ELISA检测血清细胞因子水平

检测血清中HMGB1、IL-10、TGF-β1、IL-17A和IL-23的浓度。

使用商业ELISA试剂盒检测血清样本中的细胞因子和HMGB1水平。

6

统计分析

分析组间差异及HMGB1与Treg/Th17比率的相关性。

使用Student's t检验进行组间比较,Pearson相关分析评估相关性。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
RPMI 1640培养基GibcoLot 31800-022
PMA/离子霉素混合物LiankebioLot LK-CS1001
BFA/莫能菌素混合物LiankebioLot LK-CS1002
FITC标记的抗人CD3抗体eBioscienceLot 11-0039-42
APC标记的抗人CD8抗体eBioscienceLot 17-0088-42
PE标记的抗人IL-17A抗体eBioscienceLot 85-12-7178-42
FITC标记的抗人CD4抗体eBioscienceLot 85-11-0047-42
PE标记的抗人CD25抗体eBioscienceLot 85-12-0259-42
PE-CY7标记的抗人CD127抗体eBioscienceLot 85-25-1278-42
固定/破膜缓冲液eBioscienceLot 88-8824
Accuri 6 BD流式细胞仪BD--
Trizol试剂Takara--
Prime-Script RT试剂盒SigmaLot 00171359
SYBR Premix Ex TaqTakaraLot AK8306
Agilent SureCycler 8800系统Agilent--
GAPDH引物Sangon BiotechLot PHS04
人TGF-β1 ELISA试剂盒NeoBioscienceLot EHC107b.96
人IL-10 ELISA试剂盒NeoBioscienceLot EHC009.96
人IL-17A ELISA试剂盒NeoBioscienceLot EHC170.96
人IL-23 ELISA试剂盒NeoBioscienceLot EHC171.96
HMGB1 ELISA试剂盒WestangLot F01020
酶标仪Thermo--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
患者入组
AS组:至少一条冠状动脉狭窄≥50%;NCA组:无血管疾病;样本量每组33例;排除标准包括糖尿病、近期心血管事件、感染等
阅读提示:见Materials and Methods中的Patient Population和Table 1
PBMC分离
血液量:5-10 mL肝素抗凝血;Ficoll–Hypaque梯度离心:1800 rpm,室温20分钟;细胞密度:2×10^6个/mL
阅读提示:见Materials and Methods中的Isolation of Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs)
流式细胞术
Th17分析:PMA/Ionomycin刺激6小时,BFA/Monensin存在;抗体:CD3-FITC、CD8-APC、IL-17A-PE;Treg分析:CD4-FITC、CD25-PE、CD127-PE-CY7;使用Accuri 6 BD流式细胞仪
阅读提示:见Materials and Methods中的Flow Cytometry和Figure 1 legend
qRT-PCR
RNA提取用Trizol;逆转录使用Prime-Script RT试剂盒;PCR用SYBR Premix Ex Taq,GAPDH为内参;引物序列需验证;反应条件:95℃ 15秒,60℃ 30秒,40个循环
阅读提示:见Materials and Methods中的qRT-PCR
ELISA
检测血清TGF-β1、IL-10、IL-17A、IL-23、HMGB1;所有样本重复三次;检测波长450nm;灵敏度:TGF-β1 15 pg/mL, IL-10 1 pg/mL, IL-17A 8 pg/mL, IL-23 15 pg/mL, HMGB1 0.3 ng/mL
阅读提示:见Materials and Methods中的Cytokines in Serum Determined by ELISA
统计分析
连续变量以均值±标准差表示;组间比较用Student's t检验;相关性用Pearson相关系数;显著性水平P < 0.05
阅读提示:见Materials and Methods中的Statistical Analysis