Induction of Anti-agrin Antibodies Causes Myasthenia Gravis in Mice.
包含体内主动免疫模型（小鼠）和体外细胞实验（C2C12肌管），涵盖表型、形态学、电生理和机制验证，多层级证据支持结论。
A/J小鼠主动免疫模型 C2C12肌管细胞
免疫原为重组N-agrin或M-agrin（C端片段，含或不含Z8插入），剂量25 μg，与CFA/IFA乳化 8周龄雌性A/J小鼠，皮下注射，初始免疫后第4、7、16周加强免疫 N-agrin处理C2C12肌管浓度10 ng/ml，处理16小时；血清孵育浓度1:100，时间12小时 NMJ形态分析使用胫骨前肌，Alexa Fluor 594-α-BTX标记AChR，抗NF/SYN标记神经，每只小鼠分析20个NMJ
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
获得用于免疫小鼠和体外实验的N-agrin和M-agrin重组蛋白。
PCR扩增agrin C端片段（M-agrin氨基酸1756-1939，N-agrin氨基酸1756-1947），克隆至pET-21a载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导表达，SDS-PAGE纯化，Bradford定量，Western blot验证。另将pFLAG-CMV1-N-agrin转染HEK293T细胞，收集条件培养基用于AChR聚集实验。
诱导产生抗聚集蛋白抗体，并观察是否出现MG样症状。
8周龄雌性A/J小鼠皮下注射N-agrin或M-agrin与CFA乳化液，对照组注射PBS。在第4、7、16周用IFA乳化液加强免疫。
验证免疫后小鼠产生抗agrin抗体。
通过眼眶窦采血，离心分离血清，ELISA检测抗N-agrin或抗M-agrin抗体水平。
评估免疫小鼠是否出现肌肉无力症状。
使用SR-1悬挂秤测量抓力，记录体重，进行倒置网格悬挂实验评估疲劳性。
观察免疫小鼠NMJ结构是否发生改变。
取胫骨前肌，固定后分离肌纤维，用Alexa Fluor 594-α-BTX和抗NF/SYN抗体免疫荧光染色，共聚焦显微镜采集z系列图像，量化AChR面积、碎片数和强度。
评估NMJ功能是否受损。
分离左侧半膈肌及膈神经，记录微型终板电位（mEPP）和终板电位（EPP）。
检测抗agrin抗体是否影响agrin诱导的AChR聚集。
C2C12肌管用N-agrin刺激16小时诱导AChR聚集，然后孵育对照或免疫小鼠血清，固定后用Alexa Fluor 594-α-BTX染色，量化AChR聚集数量和大小。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 重组蛋白纯化 | pET-21a载体 | Novagen | -- |
| 抗His标签抗体 | Santa Cruz | sc 803 | |
| 细胞转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| ELISA | HRP偶联的山羊抗小鼠抗体 | Cell Signaling Technology | 7076s |
| 肌力测量 | SR-1悬挂秤 | American Weigh Scales | -- |
| 电生理记录 | 芋螺毒素GIIIB | Bachem Americas | -- |
| MultiClamp 700B放大器 | -- | -- | |
| Digidata 1550A数字化仪 | -- | -- | |
| NMJ免疫荧光 | Alexa Fluor 488偶联的山羊抗兔IgG | Molecular Probes | -- |
| NMJ染色 | Alexa Fluor 594偶联的α-银环蛇毒素 | Invitrogen | -- |
| NMJ形态学 | Hydromount封片剂 | National Diagnostics | -- |
| 显微镜成像 | 奥林巴斯荧光显微镜 | Olympus | FSX100 |
| 数据分析 | Prism 7.0软件 | GraphPad Software | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白制备 | IPTG诱导浓度（0.3M）、诱导时间（4小时）、纯化方式（SDS-PAGE切胶、冻融）、蛋白定量方法（Bradford） 阅读提示：Methods 2.1 |
| 小鼠免疫 | 小鼠品系（A/J）、性别（雌性）、年龄（8周）、免疫原剂量（25 μg）、佐剂（CFA/IFA）、注射方式（皮下）、初始及加强免疫时间（第0天、第4/7/16周） 阅读提示：Methods 2.3 |
| 抗体检测 | 血清稀释度（1:800）、包被抗原浓度（10 μg/ml）、二抗浓度（1:2000）、显色底物（TMB）、检测波长（450 nm）、重复次数 阅读提示：Methods 2.4 |
| 肌力测量 | 抓力测试方法、倒置网格悬挂时间测量、重复次数（3次） 阅读提示：Methods 2.5 |
| NMJ形态学 | 固定液（4% PFA）、固定时间（30分钟）、封闭液（5% donkey serum）、一抗浓度（NF 1:1000，SYN 1:500）、二抗浓度（Alexa 488 1:1000，BTX 1:2000）、样本分析数量（20 NMJ/鼠） 阅读提示：Methods 2.6 |
| 电生理 | Ringer液成分、pH（7.3）、微电极电阻（20-40 MΩ）、mEPP记录时间（≥3分钟）、EPP刺激强度（≥130%阈值）、conotoxin浓度（1 μM） 阅读提示：Methods 2.7 |
| AChR聚集实验 | N-agrin浓度（10 ng/ml）、处理时间（16小时）、血清稀释度（1:100）、孵育时间（12小时）、BTX浓度（1:2000）、评分标准（AChR簇长度>4 μm） 阅读提示：Methods 2.8, Figure 4 legend |
| 统计分析 | 统计方法（one-way ANOVA）、数据表示（mean ± SEM）、显著性水平（P<0.05） 阅读提示：Methods 2.9 |
