重组质粒构建与酵母表达
构建PIL22-PBD-2融合基因的酵母表达载体，并在毕赤酵母中表达和纯化重组蛋白。
将猪IL-22基因与PBD-2基因通过柔性linker连接，构建pPIC9K-PIL22-PBD-2质粒，转化毕赤酵母GS115，甲醇诱导表达，His标签纯化，SDS-PAGE和Western blot验证。
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重组抗菌蛋白PIL22-PBD-2在毕赤酵母中的表达及其体外生物学功能验证
Expression of recombination antimicrobial protein PIL22-PBD-2 in Pichia pastoris and verification of its biological function in vitro.
实验完整度
高包含酵母表达与纯化、牛津杯抑菌实验、MIC测定、TEM观察、CCK8、划痕实验、qPCR/WB/IFA检测连接蛋白、流式凋亡检测、细菌粘附及qRT-PCR炎症因子分析，涵盖体外功能与机制验证。
主要模型
猪肠上皮细胞系IPEC-J2 产肠毒素大肠杆菌ETEC O8攻毒细胞模型
重点核对
重组蛋白PIL22-PBD-2的表达与纯化，SDS-PAGE和Western blot验证 牛津杯抑菌实验和MIC测定确定对ETEC O8、大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性 CCK8和划痕实验评估细胞增殖和伤口愈合 qPCR、Western blot和免疫荧光检测ZO-1和E-cadherin表达 流式细胞术评估凋亡，平板计数评估细菌粘附
摘要
寻找合适的抗生素替代品作为饲料添加剂对畜牧行业来说是一个挑战。猪β-防御素2（PBD-2）是猪产生的内源性抗菌肽。由于其广谱抗多种微生物的活性及低耐药倾向，它被认为是潜在的抗生素替代品。此外，鉴于猪白细胞介素-22（PIL-22）具有修复肠道上皮损伤和维持肠道黏膜屏障功能的强大能力，它是对抗仔猪肠道病原体引起的肠道损伤的潜在饲料添加剂。本研究将PBD-2和PIL-22的氨基酸序列结合，在毕赤酵母中表达融合蛋白，并在体外评估其生物活性。结果表明，PIL22-PBD-2对多重耐药产肠毒素大肠杆菌O8（ETEC O8）、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌表现出广谱抗菌活性。通过猪肠上皮细胞系-J2（IPEC-J2）的愈合实验，PIL22-PBD-2显示出伤口修复能力。此外，PIL22-PBD-2显著增强了IPEC-J2中主要细胞间连接相关蛋白ZO-1和E-cadherin的表达。值得注意的是，PIL22-PBD-2显着降低了ETEC O8攻毒的IPEC-J2的肠道上皮细胞凋亡（p<0.05）并减少了细菌粘附（p<0.05）。我们还发现，PIL22-PBD-2处理通过发挥抗菌活性、增加内源性抗菌肽的表达并显著降低IL-6和TNF-α的mRNA表达水平（p<0.05），减轻了ETEC O8诱导的IPEC-J2炎症反应。总之，我们的研究表明PIL22-PBD-2在抑制病原菌和修复肠道损伤方面具有积极作用。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 寻找能够替代抗生素的饲料添加剂，本研究旨在探讨重组抗菌蛋白PIL22-PBD-2是否具有抑制病原菌和修复肠道损伤的体外生物活性。
- 核心机制
- PIL22-PBD-2可能通过直接抗菌作用、促进细胞间连接蛋白表达、诱导内源性抗菌肽（如PBD-1）表达，并抑制炎症因子（IL-6、TNF-α）的表达，从而减轻ETEC O8引起的肠道上皮损伤。
- 主要证据
- 体外实验显示PIL22-PBD-2对多重耐药ETEC O8等具有抑菌活性（MIC 16-64 μg/mL），能促进IPEC-J2细胞增殖和伤口愈合，增强ZO-1和E-cadherin表达，显著降低ETEC O8诱导的细胞凋亡和细菌粘附，并下调炎症因子mRNA表达。
- 研究意义
- 研究表明PIL22-PBD-2在抑制病原菌和修复肠道损伤方面具有积极作用，为抗菌肽作为临床替代抗生素的饲料添加剂提供了参考。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外抗菌活性检测
评价PIL22-PBD-2对多种致病菌的抑菌活性和最小抑菌浓度。
采用牛津杯法检测PIL22-PBD-2对ETEC O8、大肠杆菌ATCC25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC19659和金黄色葡萄球菌ATCC25923的抑菌圈，用微量肉汤稀释法测定MIC，并用透射电镜观察细菌形态变化。
细胞增殖与迁移实验
评估PIL22-PBD-2对IPEC-J2细胞增殖和伤口愈合的影响。
使用CCK8试剂盒检测不同浓度蛋白处理后的细胞活力，通过划痕实验观察细胞迁移和伤口愈合情况。
细胞间连接蛋白表达检测
验证PIL22-PBD-2对IPEC-J2细胞紧密连接和粘附连接蛋白表达的影响。
通过qRT-PCR和Western blot检测ZO-1和E-cadherin的mRNA和蛋白水平，免疫荧光观察蛋白定位和分布。
ETEC O8攻毒保护实验
评估PIL22-PBD-2对ETEC O8感染IPEC-J2细胞的保护作用。
用蛋白预处理细胞后加入ETEC O8，通过流式细胞术检测凋亡，平板计数法评估细菌粘附，qRT-PCR检测炎症因子和防御素mRNA表达。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 质粒构建 | EcoR I限制性内切酶 | Takara Biotechnology | -- |
| Not I限制性内切酶 | Takara Biotechnology | -- | |
| T4 DNA连接酶 | Takara Biotechnology | -- | |
| 无内毒素质粒提取试剂盒 | OMEGA | -- | |
| NanoDrop 2000微量分光光度计 | Thermo Scientific | 2000 | |
| 酵母转化 | Bio-Rad电穿孔仪 | Bio-Rad | -- |
| 遗传霉素(G418) | Solarbio | -- | |
| 酵母DNA提取试剂盒 | Solarbio | -- | |
| 蛋白表达与纯化 | His标签蛋白纯化试剂盒 | 7sea Biotech | -- |
| Bradford蛋白定量试剂 | Beyotime | -- | |
| Western blot | 小鼠抗HIS标签单克隆抗体 | Abbkine Scientific Co., Ltd. | -- |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG抗体 | Abbkine Scientific Co., Ltd. | -- | |
| 抗菌实验 | 卡那霉素 | -- | 25389-94-0 |
| TEM | 超薄切片机UC7 | Leica | UC7 |
| 醋酸铀 | Thermo Fisher Scientific | 541-09-3 | |
| JEOL 1010透射电子显微镜 | JEOL | 1010 | |
| 细胞培养 | 高糖DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| 胎牛血清 | PAN | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 细胞增殖 | CCK8试剂盒 | Neobioscience | -- |
| 划痕实验 | Hanks平衡盐溶液 | Hyclone | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio | -- |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| 小鼠抗猪ZO-1单克隆抗体 | Proteintech | -- | |
| 兔源E-cadherin多克隆抗体 | Immunoway | -- | |
| 小鼠抗β-actin抗体 | Yeasen | -- | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Yeasen | -- | |
| 山羊抗小鼠IgG-HRP | Yeasen | -- | |
| 增强化学发光系统 | Bio-Rad | -- | |
| 免疫荧光 | FITC标记的山羊抗小鼠IgG | Yeasen | -- |
| TRITC标记的山羊抗兔IgG | Yeasen | -- | |
| 流式凋亡 | Annexin V-FITC | Beyotime | -- |
| 碘化丙啶 | Beyotime | 25535-16-4 | |
| FACSCantoII流式细胞仪 | BD Biosciences | FACSCantoII | |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Accurate Biology | -- |
| TransScript第一链cDNA合成SuperMix | TransGen Biotech | -- | |
| TransStart Top Green qPCR SuperMix | TransGen Biotech | -- | |
| Light Cycler 96实时荧光定量PCR仪 | Bio-Rad | 96 | |
| 统计 | GraphPad Prism 8 | GraphPad Software, Inc. | 8 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 重组蛋白表达与纯化 | 酵母菌株GS115、载体pPIC9K、甲醇诱导浓度和时间（2% v/v，96小时），电转化参数，His标签纯化步骤 阅读提示：Materials and methods: Transformation and colony PCR assay; Yeast expression of PIL22-PBD-2 |
| 抗菌活性检测 | 细菌种类和菌株（ETEC O8、E. coli ATCC25922、Salmonella ATCC19659、S. aureus ATCC25923），细菌浓度（106 CFU/mL），蛋白浓度（100 μg/mL），MIC测定方法（倍比稀释，起始256 μg/mL），共孵育时间（24小时） 阅读提示：Materials and methods: Antibacterial assay; MIC assay; Figure 2 legend |
| 细胞增殖与划痕实验 | IPEC-J2细胞系来源，细胞接种密度（96孔板1×104，6孔板1×106），蛋白处理浓度（CCK8: 2-128 μg/mL；划痕: 1和4 μg/mL），处理时间（24小时或12小时） 阅读提示：Materials and methods: Cell proliferation assay and wound healing assay; Figure 3 legend |
| 连接蛋白表达检测 | 蛋白处理浓度（4和1 μg/mL），处理时间（24小时），抗体稀释度（ZO-1, E-cadherin, β-actin），内参基因（β-actin），2-ΔΔCt方法 阅读提示：Materials and methods: qPCR and Western blot analysis; Immunofluorescence assay; Figure 4 legend |
| ETEC O8攻毒保护实验 | 蛋白预处理浓度（1或4 μg/mL）和时间（12小时），ETEC O8攻毒MOI=10和4小时，凋亡检测和粘附实验的具体操作 阅读提示：Materials and methods: Assessment of apoptosis by flow cytometry; Adhesion of ETEC O8; qRT-PCR; Figure 5 and Figure 6 legends |