建立小鼠根尖周炎模型并评估骨破坏
诱导根尖周炎并验证模型成功,评估不同时间点的病变进展。
对C57BL/6J小鼠下颌第一磨牙进行牙髓暴露,在0、7、14、21、28天取材。使用Micro-CT和高分辨率X射线评估病变面积和体积,H&E染色观察炎症浸润,TRAP染色检测破骨细胞。
The Dynamic Expression Changes of Neutrophil Extracellular Traps in Mouse Apical Periodontitis: A Potential Correlation With IL-17.
包含动物模型、组织学、影像学、免疫荧光、Western blot、RT-qPCR、ELISA及体外中性粒细胞实验等多层级验证,并含机制探讨。
小鼠根尖周炎模型(C57BL/6J小鼠下颌第一磨牙牙髓暴露) 小鼠骨髓中性粒细胞
牙髓暴露后不同时间点(0、7、14、21、28天)的取材时间 CitH3和MPO共定位的Pearson相关系数 IL-17浓度(10 ng/mL)和LPS浓度(100 ng/mL)处理中性粒细胞4小时 动物伦理审批号(WP20210535)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
诱导根尖周炎并验证模型成功,评估不同时间点的病变进展。
对C57BL/6J小鼠下颌第一磨牙进行牙髓暴露,在0、7、14、21、28天取材。使用Micro-CT和高分辨率X射线评估病变面积和体积,H&E染色观察炎症浸润,TRAP染色检测破骨细胞。
评估根尖周炎进展中NETs的表达水平及动态变化。
通过免疫荧光染色检测CitH3、MPO和NE的表达,Western blot检测CitH3蛋白水平。
检测IL-17在根尖周炎中的表达,并分析其与NETs的空间关系。
RT-qPCR检测IL-17a、TNF-α、IL-6的mRNA表达,ELISA检测IL-17蛋白水平,免疫荧光共染色CitH3和IL-17。
验证IL-17是否能促进中性粒细胞NETs的形成。
从小鼠骨髓分离中性粒细胞,用LPS(100 ng/mL)和/或IL-17(10 ng/mL)处理4小时,通过免疫荧光检测CitH3和MPO共定位评估NETs形成。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 影像学分析 | DXS PRO | Bruker Corporation | -- |
| SkyScan 1276 | Bruker microCT | -- | |
| 组织学染色 | TRAP染色试剂盒 | Sigma | 387A |
| 免疫荧光实验 | 胃蛋白酶 | Maixin | DIG-3009 |
| 抗CitH3抗体 | Abcam | ab5103 | |
| 抗MPO抗体 | R&D Systems | AF3667 | |
| 抗IL-17抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-374218 | |
| 抗NE抗体 | EPITOMICS | 5953-S | |
| 驴抗山羊IgG(Dylight 488) | Abbkine | A24231 | |
| 山羊抗小鼠IgG(Dylight 488) | Abbkine | A23210 | |
| 山羊抗兔IgG(Dylight 594) | Abbkine | A23420 | |
| DAPI封片剂 | Zhongshan | ZLI-9600 | |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013B |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | MedChemExpress | HY-K0010, | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 | |
| PVDF膜 | Roche | 03010040001 | |
| β-肌动蛋白抗体 | Proteintech | 66009-1 | |
| HRP标记的抗兔二抗 | Cell Signaling Technology | 7075S | |
| HRP标记的抗小鼠二抗 | Cell Signaling Technology | 7076S | |
| RT-qPCR | TRIzol试剂 | Invitrogen | 15596026 |
| 逆转录反应试剂盒 | Vazyme | R223-01 | |
| SYBR qPCR预混液 | Vazyme | Q312-02 | |
| CFX384PCR系统 | Roche | -- | |
| ELISA | IL-17 ELISA试剂盒 | NEOBIOSCIENCE | EMC008 |
| 中性粒细胞分离 | 中性粒细胞分离试剂盒 | TBD Science | TBD2013NM |
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | 11965092 |
| 胎牛血清 | Sigma | F2442 | |
| 细胞处理 | 脂多糖(LPS) | Sigma | LPS25 |
| IL-17 | MedChemExpress | HY-P73174 | |
| 细胞免疫荧光 | 共聚焦显微镜(Olympus SpinSR) | Olympus | -- |
| 荧光显微镜 | 荧光显微镜 | Leica | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型建立 | 小鼠品系、性别、年龄、体重、麻醉剂量、牙髓暴露方法、取材时间点 阅读提示:参见Materials and Methods 2.1和2.2节 |
| 影像学评估 | Micro-CT扫描参数、图像分析软件、盲法测量者数量 阅读提示:参见Materials and Methods 2.3节 |
| 组织学分析 | 切片厚度、染色方法、炎症浸润和破骨细胞计数标准 阅读提示:参见Materials and Methods 2.4和2.5节 |
| 免疫荧光染色 | 抗原修复方法、一抗浓度、二抗浓度、共定位定量方法(Pearson相关系数) 阅读提示:参见Materials and Methods 2.6节 |
| Western blot | 蛋白提取方法、上样量、抗体稀释比例 阅读提示:参见Materials and Methods 2.7节 |
| RT-qPCR和ELISA | RNA提取方法、引物序列、IL-17检测试剂盒 阅读提示:参见Materials and Methods 2.8和2.9节 |
| 体外中性粒细胞实验 | 中性粒细胞来源、分离方法、培养条件、LPS和IL-17浓度及处理时间 阅读提示:参见Materials and Methods 2.10和2.11节 |
| 统计分析 | 正态性检验、组间比较方法、显著性水平 阅读提示:参见Materials and Methods 2.12节 |