小鼠根尖周炎中中性粒细胞胞外陷阱的动态表达变化:与IL-17的潜在相关性

The Dynamic Expression Changes of Neutrophil Extracellular Traps in Mouse Apical Periodontitis: A Potential Correlation With IL-17.

作者信息Zihan Ma, Xiaoyue Sun, Ying Lin, Zijun Wang, Qing Nie, Jingjing Yu, Jingwen Yang, Lingxin Zhu
PMID41031144
发布时间2025-09-15
DOI10.1155/jimr/8039031

实验完整度

高

包含动物模型、组织学、影像学、免疫荧光、Western blot、RT-qPCR、ELISA及体外中性粒细胞实验等多层级验证,并含机制探讨。

主要模型

小鼠根尖周炎模型(C57BL/6J小鼠下颌第一磨牙牙髓暴露) 小鼠骨髓中性粒细胞

重点核对

牙髓暴露后不同时间点(0、7、14、21、28天)的取材时间 CitH3和MPO共定位的Pearson相关系数 IL-17浓度(10 ng/mL)和LPS浓度(100 ng/mL)处理中性粒细胞4小时 动物伦理审批号(WP20210535)

摘要

中性粒细胞胞外陷阱(NETs)由去浓缩的染色质和抗菌蛋白组成,由中性粒细胞释放,并已被认为与多种炎症性疾病有关。NETs和白细胞介素(IL)-17构成一个正反馈环路,促进炎症的免疫病理发展。因此,本研究旨在探讨在已建立的小鼠模型中,NETs在根尖周炎进展过程中的动态分布及其与IL-17的共定位。通过暴露下颌第一磨牙的牙髓诱导小鼠根尖周炎,并在牙髓暴露后第0、7、14、21和28天收取下颌骨。Micro-CT和高分辨率X射线扫描显示,从第0天到第28天,根尖周病变的面积和体积逐渐增加。使用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色鉴定根尖周病变中的破骨细胞,其数量在第21天达到峰值。对瓜氨酸化组蛋白H3(CitH3)、髓过氧化物酶(MPO)、中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)和IL-17进行免疫荧光染色,以定位NETs及其与IL-17在病变中的共定位。NETs在第7天可见,逐渐增加至第21天,主要位于根尖周组织的炎症浸润区域。此外,Western blot分析显示,牙髓暴露后第21天根尖周病变中CitH3表达增加,进一步证实了NETs的存在。RT-qPCR和酶联免疫吸附测定(ELISA)均显示根尖周病变中IL-17表达增加。CitH3(NETs的主要成分)和IL-17的共定位在牙髓暴露后第21天达到峰值。此外,体外实验表明,在脂多糖(LPS)模拟的炎症条件下,IL-17促进了NETs的形成。我们的研究结果表明,在小鼠根尖周炎发展过程中,NETs表达动态变化,并提示NETs与IL-17之间存在反馈环路。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
在根尖周炎进展过程中,NETs是否动态变化,并与IL-17存在相关性?
核心机制
NETs与IL-17可能形成正反馈环路,促进根尖周炎的炎症进展和骨破坏。
主要证据
小鼠根尖周炎模型中,NETs在第21天达到峰值,与IL-17共定位;体外实验显示IL-17在LPS存在下促进NETs形成。
研究意义
研究为探索根尖周炎的非侵入性治疗提供新可能性,并拓展对炎症性骨溶解疾病病理机制的理解。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立小鼠根尖周炎模型并评估骨破坏

诱导根尖周炎并验证模型成功,评估不同时间点的病变进展。

对C57BL/6J小鼠下颌第一磨牙进行牙髓暴露,在0、7、14、21、28天取材。使用Micro-CT和高分辨率X射线评估病变面积和体积,H&E染色观察炎症浸润,TRAP染色检测破骨细胞。

2

检测NETs的动态变化

评估根尖周炎进展中NETs的表达水平及动态变化。

通过免疫荧光染色检测CitH3、MPO和NE的表达,Western blot检测CitH3蛋白水平。

3

评估IL-17表达及与NETs共定位

检测IL-17在根尖周炎中的表达,并分析其与NETs的空间关系。

RT-qPCR检测IL-17a、TNF-α、IL-6的mRNA表达,ELISA检测IL-17蛋白水平,免疫荧光共染色CitH3和IL-17。

4

体外验证IL-17对NETs形成的作用

验证IL-17是否能促进中性粒细胞NETs的形成。

从小鼠骨髓分离中性粒细胞,用LPS(100 ng/mL)和/或IL-17(10 ng/mL)处理4小时,通过免疫荧光检测CitH3和MPO共定位评估NETs形成。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
DXS PROBruker Corporation--
SkyScan 1276Bruker microCT--
TRAP染色试剂盒Sigma387A
胃蛋白酶MaixinDIG-3009
抗CitH3抗体Abcamab5103
抗MPO抗体R&D SystemsAF3667
抗IL-17抗体Santa Cruz Biotechnologysc-374218
抗NE抗体EPITOMICS5953-S
驴抗山羊IgG(Dylight 488)AbbkineA24231
山羊抗小鼠IgG(Dylight 488)AbbkineA23210
山羊抗兔IgG(Dylight 594)AbbkineA23420
DAPI封片剂ZhongshanZLI-9600
RIPA裂解液BeyotimeP0013B
蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物MedChemExpressHY-K0010,
BCA蛋白定量试剂盒BeyotimeP0012
PVDF膜Roche03010040001
β-肌动蛋白抗体Proteintech66009-1
HRP标记的抗兔二抗Cell Signaling Technology7075S
HRP标记的抗小鼠二抗Cell Signaling Technology7076S
TRIzol试剂Invitrogen15596026
逆转录反应试剂盒VazymeR223-01
SYBR qPCR预混液VazymeQ312-02
CFX384PCR系统Roche--
IL-17 ELISA试剂盒NEOBIOSCIENCEEMC008
中性粒细胞分离试剂盒TBD ScienceTBD2013NM
杜氏改良Eagle培养基Gibco11965092
胎牛血清SigmaF2442
脂多糖(LPS)SigmaLPS25
IL-17MedChemExpressHY-P73174
共聚焦显微镜(Olympus SpinSR)Olympus--
荧光显微镜Leica--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型建立
小鼠品系、性别、年龄、体重、麻醉剂量、牙髓暴露方法、取材时间点
阅读提示:参见Materials and Methods 2.1和2.2节
影像学评估
Micro-CT扫描参数、图像分析软件、盲法测量者数量
阅读提示:参见Materials and Methods 2.3节
组织学分析
切片厚度、染色方法、炎症浸润和破骨细胞计数标准
阅读提示:参见Materials and Methods 2.4和2.5节
免疫荧光染色
抗原修复方法、一抗浓度、二抗浓度、共定位定量方法(Pearson相关系数)
阅读提示:参见Materials and Methods 2.6节
Western blot
蛋白提取方法、上样量、抗体稀释比例
阅读提示:参见Materials and Methods 2.7节
RT-qPCR和ELISA
RNA提取方法、引物序列、IL-17检测试剂盒
阅读提示:参见Materials and Methods 2.8和2.9节
体外中性粒细胞实验
中性粒细胞来源、分离方法、培养条件、LPS和IL-17浓度及处理时间
阅读提示:参见Materials and Methods 2.10和2.11节
统计分析
正态性检验、组间比较方法、显著性水平
阅读提示:参见Materials and Methods 2.12节