微泡分离与表征
验证LPS刺激的巨噬细胞释放的微泡含有线粒体成分
从LPS或PBS处理的Raw264.7细胞上清中通过差速离心分离微泡，使用NTA和透射电镜表征微泡大小和形态，电镜显示微泡内含有线粒体。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
微泡传递的线粒体触发cGAS-STING并重编程脓毒症中巨噬细胞的代谢
Microvesicle-transferred mitochondria trigger cGAS-STING and reprogram metabolism of macrophages in sepsis.
实验完整度
高包含体外细胞实验（Raw264.7、BMDM）、体内小鼠实验、代谢组学分析，以及功能验证和机制验证（cGAS-STING通路、二甲双胍抑制）。
主要模型
Raw 264.7细胞系 小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM） C57BL/6J小鼠模型
重点核对
LPS浓度100 ng/mL处理Raw264.7细胞24小时诱导微泡产生 微泡来源细胞数：体外1.2×10^8细胞，体内2.4×10^8细胞 二甲双胍处理浓度1 mM，作用48小时 MitoTracker Deep Red FM标记微泡线粒体，MitoTracker Green标记内源线粒体 JC-1染料检测线粒体膜电位，MitoSOX检测线粒体超氧化物
摘要
炎症细胞因子风暴是脓毒症的标志，且与器官损伤高度相关。因此，抑制炎症细胞因子的产生是有效治疗该疾病的直接策略。在本研究中，我们发现来自脂多糖（LPS）预处理的巨噬细胞的微泡可以将线粒体转移至其他巨噬细胞并改变其生物学功能。通过透射电子显微镜对来自LPS预处理的巨噬细胞的微泡进行分离和表征。通过免疫荧光和实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）评估炎症细胞因子的表达水平，以及使用体外和体内模型进行代谢组学，评估了微泡转移的线粒体在巨噬细胞中的功能。来自LPS预处理的巨噬细胞的微泡能够将线粒体转移至其他巨噬细胞。在功能上，这些微泡诱导经典活化巨噬细胞（M1）极化，降低吞噬能力，改变巨噬细胞的线粒体稳态和代谢，并最终在体内引起器官损伤。在机制上，我们证明了二甲双胍可以抑制微泡转移的线粒体活性氧（mtROS）和环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶（cGAS）-干扰素基因刺激因子（STING）-干扰素β（IFN-β）信号通路活性，随后减少炎症细胞因子的产生。我们的研究结果表明，mtROS的产生是脓毒症炎症细胞因子风暴中的一个关键细胞反应，cGAS-STING-IFN-β信号通路可能成为脓毒症治疗的新靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 微泡介导的线粒体转移是否通过激活cGAS-STING-IFN-β通路诱导巨噬细胞炎症和代谢重编程，从而促进脓毒症炎症因子风暴？
- 核心机制
- LPS预处理的巨噬细胞释放的微泡将线粒体转移至受体巨噬细胞，引起线粒体功能障碍和mtROS产生增加，激活cGAS-STING-IFN-β信号通路，导致M1极化和炎症因子产生，并造成器官损伤；二甲双胍通过减少mtROS抑制该通路。
- 主要证据
- 体外实验显示LPS-MVs降低线粒体膜电位、增加mtROS、上调cGAS/STING/IFN-β表达，并诱导M1标记物和炎症因子；体内注射LPS-MVs导致巨噬细胞浸润、器官损伤和炎症因子升高；代谢组学显示代谢重编程。
- 研究意义
- 研究揭示mtROS/cGAS-STING-IFN-β是脓毒症炎症因子风暴的关键治疗靶点，并提出二甲双胍作为潜在治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
微泡线粒体转移验证
验证LPS-MVs能将线粒体转移至受体巨噬细胞
用MitoTracker Deep Red标记LPS-MVs，与预标记MitoTracker Green的BMDMs共培养，共聚焦显微镜观察线粒体共定位。
线粒体功能评估
评估LPS-MVs对受体巨噬细胞线粒体功能的影响
通过TEM观察线粒体结构，JC-1染色检测膜电位，MitoSOX检测mtROS，BBoxiProbe R01试剂盒检测OCR。
巨噬细胞表型和功能检测
验证LPS-MVs是否诱导M1极化和吞噬功能变化
通过qRT-PCR检测M1标记物（CCL5、IL-6、TNF-α）和M2标记物，ELISA检测炎症因子分泌，通过吞噬实验评估对凋亡中性粒细胞和NETs的吞噬能力，Western blot检测SIRPA表达。
信号通路验证
验证LPS-MVs是否激活cGAS-STING-IFN-β通路，以及二甲双胍的抑制作用
通过Western blot和qRT-PCR检测cGAS、STING、IFN-β的表达，检测磷酸化STING水平，并检测二甲双胍处理后mtROS和通路表达的变化。
代谢组学分析
分析LPS-MVs对巨噬细胞代谢重编程的影响
对处理后的BMDM进行非靶向代谢组学分析（Metabolon），通过PCA、差异表达和通路富集分析代谢物变化。
体内效应评估
验证LPS-MVs在体内是否诱导器官损伤和全身炎症
通过尾静脉注射PBS-MVs或LPS-MVs（每只小鼠来源于2.4×10^8细胞的微泡），24小时后收集血液和组织，进行组织学分析（H&E）、免疫组化（F4/80）、TUNEL染色、生化学指标和ELISA检测。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| RPMI 1640培养基 | -- | -- | |
| 微泡分离 | 线粒体分离试剂盒 | Beyotime | -- |
| 透射电镜 | HT7800透射电镜 | Hitachi | -- |
| 纳米颗粒分析 | ZetaView纳米颗粒分析仪 | -- | -- |
| 线粒体转移 | MitoTracker深红色荧光探针 | -- | -- |
| MitoTracker绿色荧光探针 | -- | -- | |
| 微泡摄取 | PKH-67染料 | -- | -- |
| TRITC标记的鬼笔环肽 | -- | -- | |
| DAPI染液 | -- | -- | |
| Fluoromount-G封片剂 | -- | -- | |
| 线粒体膜电位 | JC-1染料 | Beyotime | C2006 |
| 线粒体超氧化物 | MitoSOX探针 | Thermo Fisher | M36008 |
| 耗氧率检测 | BBoxiProbe R01试剂盒 | Bestbio | -- |
| 蛋白质印迹 | 抗cGAS抗体 | Abcam | ab252416 |
| 抗STING抗体 | Abcam | ab288157 | |
| 抗SIRPA抗体 | -- | SAB33486 | |
| 抗β-actin抗体 | Abmart | T40104 | |
| 二抗 | HUABIO | Ha1031 | |
| ChemiDoc MP成像系统 | BIORAD | -- | |
| RNA提取 | 总RNA提取试剂盒 | Promega | Is1040 |
| RT-qPCR | SYBR绿色预混液 | Yeason | -- |
| StepOnePlus实时PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 组织学 | F4/80抗体 | Servicebio | GB11027 |
| TUNEL试剂盒 | Servicebio | G1501 | |
| 细胞因子检测 | IL-1β ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- |
| IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- | |
| TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- | |
| Infinite M200酶标仪 | Tecan | -- | |
| 代谢组学 | Bradford蛋白定量试剂盒 | -- | -- |
| 细胞培养 | 脂多糖 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 微泡分离与表征 | LPS浓度100 ng/mL处理24小时；离心参数260×g、5分钟和20,000×g、30分钟；微泡数量根据细胞数确定。 阅读提示：Materials and Methods, Isolation of microvesicles from Raw 264.7 cells |
| 线粒体转移检测 | MitoTracker Deep Red FM和MitoTracker Green浓度均为200 nM；染色时间45分钟；共培养时间24小时。 阅读提示：Materials and Methods, Mitochondrial transfer assay |
| 线粒体功能评估 | 检测JC-1（20 µM）和MitoSOX（5 µM）浓度；处理时间24小时。 阅读提示：Materials and Methods, Measurement of mitochondrial membrane potential, Detection of mitochondrial superoxide production |
| 巨噬细胞表型和功能 | 处理时间24小时（qPCR/ELISA）或48小时（吞噬/Western blot）；吞噬实验中凋亡中性粒细胞和NETs数量；SIRPA表达。 阅读提示：Materials and Methods, Measurement of macrophage dysfunction, In vitro phagocytosis assay |
| 信号通路验证 | 处理时间48小时；二甲双胍浓度1 mM；检测cGAS、STING、IFN-β表达。 阅读提示：Materials and Methods, Treatment with metformin, Western blot analysis, Quantitative real-time polymerase chain reaction |
| 体内实验 | 每组4只C57BL/6J小鼠；尾静脉注射微泡（来源于2.4×10^8细胞）；24小时后检测。 阅读提示：Materials and Methods, In vivo MV administration to WT C57BL/6 Mice |
| 代谢组学 | 处理时间48小时；每组6个样本；差异代谢物筛选标准。 阅读提示：Materials and Methods, Metabolic measurements |