生物信息学分析HBD2表达
比较宫颈鳞状细胞癌组织与正常组织中HBD2 mRNA水平。
使用UALCAN服务器分析TCGA数据库中305个宫颈鳞状细胞癌样本和3个正常对照样本的mRNA测序数据。
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HPV16 E7通过下调ASK1-p38 MAPK通路抑制宫颈癌中HBD2的表达。
HPV16 E7 inhibits HBD2 expression by down-regulation of ASK1-p38 MAPK pathway in cervical cancer.
实验完整度
高包含生物信息学分析、体外细胞实验（HPV16 E7过表达/敲低、通路抑制剂、shRNA）、Western blot、RT-qPCR、ELISA、CCK-8和凋亡检测等多层级验证，并进行了功能与机制验证。
主要模型
宫颈癌细胞系C33A（HPV阴性） 宫颈癌细胞系CaSki（HPV16阳性） 宫颈癌细胞系SiHa（HPV16阳性） 宫颈癌细胞系CaCo2（HPV阴性）
重点核对
HPV16 E7敲低或过表达对HBD2 mRNA和蛋白水平的影响 ASK1-p38 MAPK通路抑制剂（SB-203580、GS-4997）处理浓度和时间（60或80 μM、50或60 μM，24小时） Anisomycin处理浓度（0-5.0 μM）和时间（24小时）对p-p38、HBD2表达和细胞活力的影响 细胞系来源和培养条件（DMEM或RPMI 1640，10% FBS，37°C，5% CO2）
摘要
背景
近期研究表明，人β防御素2（HBD2）在宫颈癌细胞中表达下调，但其机制和临床意义尚不清楚。
方法
本文基于TCGA数据库数据，使用UALCAN服务器提供的生物信息学分析。通过RT-qPCR检测细胞中HBD2 mRNA水平，并通过ELISA检测细胞培养上清液中蛋白浓度。当人乳头瘤病毒16型E7癌蛋白（HPV16 E7）基因过表达或敲低时，通过Western blot检测ASK1和p38 MAPK的蛋白表达。
结果
生物信息学分析结果表明，宫颈癌中HBD2的mRNA水平明显低于健康人。在HPV16 E7基因沉默条件下，CaSki和SiHa细胞中HBD2 mRNA和蛋白水平明显升高。然而，在C33A和CaCo2细胞中，不仅在用HPV16 E7基因过表达处理，而且用SB-203580或GS-4997抑制ASK1-p38 MAPK通路，或转染ASK1的shRNA表达质粒的情况下，HBD2 mRNA和蛋白水平均显著降低。此外，在伴有HPV16 E7过表达的C33A和CaCo2细胞中，ASK1的活性形成蛋白p-ASK1(Thr845)和p-p38减少，而抑制性形成蛋白p-ASK1(Ser966)保持相同稳定水平。在转染HPV16 E7 siRNA序列的CaSki和SiHa细胞中，ASK1-p38 MAPK通路蛋白表达模式完全相反。有趣的是，与DMSO溶液相比，暴露于Anisomycin的SiHa细胞中磷酸化p38水平和细胞凋亡率在统计学上更高。同时，在CaSki和SiHa细胞中用Anisomycin处理，证实了细胞培养上清液中HBD2蛋白浓度增加和细胞存活率降低。
结论
我们的结果表明，HPV16 E7通过抑制ASK1-p38 MAPK信号通路抑制HBD2表达，这一机制可能是Anisomycin抗肿瘤作用的关键途径。本研究为肿瘤中HBD2的表达和调控机制提供了新的见解，并为未来利用防御素治疗宫颈癌提供了可能的治疗策略。
补充信息
在线版本包含补充材料，可访问10.1186/s12985-025-02731-9。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- HPV16 E7是否通过ASK1-p38 MAPK信号通路调控宫颈癌中HBD2的表达，以及HBD2是否参与Anisomycin的抗肿瘤作用。
- 核心机制
- HPV16 E7通过抑制ASK1-p38 MAPK信号通路的激活（降低p-ASK1 Thr845和p-p38水平，升高p-ASK1 Ser966水平）来下调HBD2表达。
- 主要证据
- 在CaSki和SiHa细胞中敲低HPV16 E7显著增加HBD2表达，并激活ASK1-p38通路；在C33A和CaCo2细胞中过表达HPV16 E7则相反。使用SB-203580或GS-4997抑制ASK1-p38通路降低HBD2表达。Anisomycin激活p38 MAPK，增加HBD2表达并诱导细胞凋亡。
- 研究意义
- 该机制可能有助于HPV16免疫逃逸和宫颈癌肿瘤发生，HBD2可能是Anisomycin治疗宫颈癌疗效的重要因素，为基于防御素的治疗策略提供潜在方向。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
HPV16 E6/E7敲低实验
验证HPV16 E6或E7对HBD2表达的影响。
在SiHa和CaSki细胞中转染50 nM HPV16 E6/E7 siRNA或对照siRNA，48小时后检测基因敲低效率，并检测HBD2 mRNA和蛋白水平。
HPV16 E7过表达实验
验证HPV16 E7过表达对HBD2表达的影响。
构建pcDNA3.1-3FLAG-HPV16 E7质粒，转染到C33A和CaCo2细胞，48小时后检测E7蛋白表达，并检测HBD2 mRNA和蛋白水平。
ASK1-p38通路抑制实验
验证ASK1-p38 MAPK通路对HBD2表达的影响。
用p38抑制剂SB-203580和ASK1抑制剂GS-4997处理C33A和CaCo2细胞，或用shASK1质粒转染，检测HBD2表达和p38磷酸化水平。
HPV16 E7对ASK1-p38通路的影响
验证HPV16 E7是否调控ASK1-p38 MAPK通路的激活。
在SiHa和CaSki细胞中敲低HPV16 E7，或在C33A和CaCo2细胞中过表达HPV16 E7，检测ASK1、p-ASK1(Thr845)、p-ASK1(Ser966)、p38和p-p38的蛋白水平。
Anisomycin处理实验
验证p38激活剂Anisomycin对HBD2表达、细胞活力及凋亡的影响。
用不同浓度Anisomycin处理SiHa、CaSki和C33A细胞，检测p-p38水平、HBD2表达、细胞活力和凋亡。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 生物信息学分析 | UALCAN | -- | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | Sijiqing | -- | |
| 细胞培养和转染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Solarbio Technology | -- |
| HPV16 E7抗体 | Santa Cruz | 1:200 | |
| ASK1抗体 | Proteintech | 1:1500 | |
| p-ASK1 (Ser966)抗体 | Proteintech | 1:500 | |
| p-ASK1 (Thr845)抗体 | Immunoway | 1:1500 | |
| p38抗体 | Proteintech | 1:1000 | |
| p-p38 (Thr180/Tyr182)抗体 | Proteintech | 1:1000 | |
| GAPDH抗体 | Proteintech | 1:1000 | |
| FLAG抗体 | Sigma | 1:1000 | |
| HRP标记的抗兔IgG | Boster Bio | 1:5000 | |
| RT-qPCR | RNAiso Plus试剂 | Takara | -- |
| PrimeScript RT预混液 | Takara | -- | |
| SYBR Green实时PCR预混液 | Mei5bio | -- | |
| StepOne PLUS实时荧光定量PCR仪 | Applied Biosystems | -- | |
| ELISA | ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology | -- |
| 细胞活力检测 | CCK-8细胞活力检测试剂盒 | APExBIO | -- |
| 凋亡检测 | 凋亡检测试剂盒 | Bestbio | -- |
| 药物处理 | 茴香霉素 | -- | -- |
| SB-203580 | -- | -- | |
| GS-4997 | -- | -- | |
| 转染 | 二甲基亚砜 | -- | -- |
| 凋亡检测 | Annexin V结合缓冲液 | -- | -- |
| 碘化丙啶 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 生物信息学分析 | TCGA数据库中的样本类型和数量（305个CESC样本和3个正常对照） 阅读提示：Methods: Bioinformatics analysis |
| 细胞培养 | 细胞系来源（C33A和CaSki购自Fenghuishengwu，SiHa和CaCo2来自实验室库存）、培养基（DMEM或RPMI 1640）、血清浓度（10% FBS）、培养条件（37°C，5% CO2） 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection |
| HPV16 E6/E7敲低 | siRNA浓度（50 nM）、处理时间（48小时）、转染试剂（Lipofectamine 2000） 阅读提示：Methods: HPV16 E6/E7 SiRNA knockdown experiments |
| HPV16 E7过表达 | 质粒构建（pcDNA3.1-3FLAG-HPV16 E7）、转染量（3 µg）、处理时间（48小时） 阅读提示：Methods: Plasmid constructions; Cell culture and transfection |
| ASK1-p38通路抑制 | SB-203580浓度（60或80 µM）、GS-4997浓度（60或50 µM）、处理时间（24小时）、shASK1质粒转染 阅读提示：Methods: Cell culture and transfection (shASK1); Results: ASK1-p38 MAPK pathway could induce HBD2 expression |
| Western blot | 抗体及其稀释比例（如anti-ASK1 1:1500等）、内参（GAPDH）、ECL显色系统 阅读提示：Methods: Western blot analysis |
| RT-qPCR | RNA提取试剂（RNAiso Plus）、逆转录试剂（PrimeScript RT Master Mix）、SYBR Green试剂、内参基因（GAPDH）、重复次数（三次） 阅读提示：Methods: RNA extraction and real-time quantitative PCR assay |
| ELISA | 样本（细胞培养上清液）、试剂盒品牌（NeoBioscience Technology）、检测波长（450 nm） 阅读提示：Methods: ELISA |
| 细胞活力检测 | Anisomycin处理浓度和时间（24小时）、CCK-8孵育时间（2-4小时）、检测波长（450 nm） 阅读提示：Methods: Cell viability assay; Results: HBD2 might involve the treatment effects of anisomycin (Fig. 5C) |
| 凋亡检测 | Anisomycin处理浓度（0-5.0 µM）、处理时间（24小时）、Annexin V/PI染色步骤、流式细胞仪 阅读提示：Methods: Apoptosis assay; Results: Fig. 5D-E |