能量应激抑制NOD1信号
探究能量应激是否影响NOD1介导的信号传导
用葡萄糖饥饿、2-DG和二甲双胍处理BMDM和iBMDM细胞，检测NOD1激动剂C12-iE-DAP诱导的p65和p38磷酸化及IL-6释放。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
AMPK介导的ZDHHC5磷酸化对NOD1信号传导的代谢调控
Metabolic orchestration of NOD1 signaling by AMPK-mediated phosphorylation of ZDHHC5.
实验完整度
高包含体外细胞模型（HEK293T、iBMDM、BMDM）和生化分析（免疫共沉淀、激酶实验、质谱），并进行了功能验证（NOD1棕榈酰化、膜定位及信号传导）。
主要模型
小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM） 永生化BMDM（iBMDM） HEK293T细胞 AMPKα野生型(WT)和双敲除(DKO)小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)
重点核对
AMPK在Ser296和Ser380磷酸化ZDHHC5 ZDHHC5磷酸化削弱其与Golga7B结合并减少膜定位 ZDHHC5膜定位减少降低NOD1棕榈酰化及信号传导 NOD1激活抑制AMPK活性以维持ZDHHC5功能
摘要
先天免疫反应必须与细胞代谢状态相协调。细胞内模式识别受体NOD1检测细菌肽聚糖并从细胞膜启动信号传导，这一过程由ZDHHC5介导的棕榈酰化调控。通过生化分析和免疫活性细胞模型，我们发现AMP活化蛋白激酶（AMPK）通过调控ZDHHC5将代谢信号整合到NOD1信号传导中。AMPK在Ser296和Ser380位点磷酸化ZDHHC5，削弱其与Golga7B的结合，并促进其从质膜上脱离，从而降低NOD1的棕榈酰化、膜定位和下游信号。相反，NOD1激动剂C12-iE-DAP刺激抑制AMPK活性，使ZDHHC5稳定在膜上并维持NOD1激活。这些发现定义了一个连接代谢应激感知和先天免疫信号的相互调控回路，并阐明了代谢途径如何控制先天免疫中模式识别受体的空间定位。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 细胞能量状态如何调节NOD1信号传导？
- 核心机制
- AMPK磷酸化ZDHHC5（Ser296/380），削弱其与Golga7B结合和膜定位，进而减少NOD1棕榈酰化、膜定位和下游信号；NOD1激活则抑制AMPK，形成负反馈回路。
- 主要证据
- 通过生化分析（免疫共沉淀、激酶实验、质谱）和细胞模型（BMDM、iBMDM、HEK293T、MEF）证明AMPK-ZDHHC5轴调控NOD1棕榈酰化和信号传导。
- 研究意义
- 揭示了代谢信号与先天免疫之间的联系，并提出调节AMPK-ZDHHC5通路可能为NOD1驱动的炎症疾病（如克罗恩病）提供治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
AMPK在能量应激下抑制NOD1信号
验证AMPK是否介导能量应激对NOD1信号的抑制
使用AMPK抑制剂Compound C和激活剂MK-8722，观察对NOD1信号的影响，并检测AMPK磷酸化水平。
AMPK抑制NOD1棕榈酰化
确定能量应激是否通过AMPK影响NOD1棕榈酰化
用代谢应激处理细胞，通过点击化学和ABE检测NOD1棕榈酰化水平，并使用AMPK抑制剂和AMPKα DKO MEFs验证AMPK的作用。
AMPK与ZDHHC5相互作用并磷酸化
验证AMPK是否与ZDHHC5直接相互作用并磷酸化
通过免疫共沉淀、GST pull-down和体外激酶实验检测AMPK与ZDHHC5的相互作用和磷酸化，并用质谱鉴定磷酸化位点。
AMPK磷酸化减少ZDHHC5质膜定位
阐明AMPK磷酸化对ZDHHC5膜定位和棕榈酰化的影响
检测代谢应激下ZDHHC5的棕榈酰化、亚细胞定位及其与Golga7B的相互作用，并使用2A突变体验证磷酸化位点的作用。
ZDHHC5磷酸化抑制NOD1信号
验证AMPK介导的ZDHHC5磷酸化是否影响NOD1信号
在ZDHHC5敲除或敲低的巨噬细胞中回补WT或2A突变体，比较NOD1棕榈酰化、膜定位、信号传导和细胞因子产生。
NOD1激动剂抑制AMPK-ZDHHC5轴
探究NOD1激活对AMPK-ZDHHC5轴的反馈调节
C12-iE-DAP刺激巨噬细胞，检测ZDHHC5磷酸化、棕榈酰化、膜定位及NOD1棕榈酰化变化，并用二甲双胍激活AMPK观察逆转效果。
疾病相关NOD1突变体的调控
初步探索AMPK-ZDHHC5轴在疾病相关NOD1突变体中的调控作用
检测克罗恩病相关NOD1 E266K突变体的棕榈酰化水平及其对葡萄糖饥饿的敏感性。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | 11-965-118 |
| 胎牛血清 | Gibco | 10270-106 | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | -- | -- | |
| 细胞转染 | 聚乙烯亚胺 | Polysciences Inc | 23966-2 |
| Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂 | Thermo Fisher | 13778100 | |
| 药物处理 | 2-脱氧-D-葡萄糖 | MCE | HY-13966 |
| MK-8722 | MCE | HY-111363 | |
| 化合物C | -- | -- | |
| NOD1激动剂 | C12-iE-DAP | Invivogen | tlrl-c12dap |
| 棕榈酰化检测 | 炔基棕榈酸 | Click Chemistry Tools | 1165 |
| 生物素吡啶叠氮化物 | Click Chemistry Tools | 1167 | |
| 2-溴十六烷酸 | Millipore Sigma | 238422 | |
| EZ-Link BMCC-生物素 | Thermo Fisher | 21900 | |
| N-乙基马来酰亚胺 | Millipore Sigma | E3876 | |
| 羟胺溶液 | Millipore Sigma | 467804 | |
| 三[(1-苄基-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基]胺 | Millipore Sigma | 678937 | |
| 五水硫酸铜(II) | Millipore Sigma | 469130 | |
| 三(2-羧乙基)膦 | Millipore Sigma | C4706 | |
| 免疫沉淀 | ANTI-FLAG® M2亲和凝胶 | Millipore Sigma | A2220 |
| EZview™ 红色抗HA亲和凝胶 | Millipore Sigma | E6779 | |
| 蛋白A/G琼脂糖珠 | -- | -- | |
| 链霉亲和素琼脂糖 | Thermo Fisher | SA10004 | |
| 蛋白质检测 | 预染蛋白质标准品 | Thermo Fisher | 26616 |
| 免疫荧光 | DAPI | -- | -- |
| 山羊血清 | -- | -- | |
| 皂苷 | -- | -- | |
| 显微镜 | 尼康A1R荧光共聚焦显微镜 | Nikon | -- |
| ELISA | QuantiCyto®小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology | EMC004 |
| QuantiCyto®小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience Technology | EMC102a | |
| 质谱分析 | 质谱仪 | -- | -- |
| 细菌培养 | 大肠杆菌TOP10 | Tiangen | CB104 |
| 大肠杆菌BL21 | Tiangen | CB105 | |
| 大肠杆菌Stbl3 | Thermo Fisher | C739601 | |
| 分子克隆 | pGEX-4T-2载体 | GE healthcare | 28-9545-50 |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与处理 | 细胞类型（BMDM/iBMDM/HEK293T/MEF），葡萄糖饥饿持续时间（6小时），2-DG浓度（25 mM），二甲双胍浓度（2 mM or 5 mM），MK-8722浓度（2 μM），C12-iE-DAP浓度（1 μg/mL或5 μg/mL）和刺激时间（30分钟或7小时） 阅读提示：STAR Methods 'Cell culture'，图1图注，图2图注 |
| AMPK活性调控 | AMPK激活剂MK-8722 (2 μM, 8小时)，抑制剂Compound C (5 μM)预处理时间，AMPKα DKO MEFs的使用 阅读提示：STAR Methods 'Cell culture'，图1H，图2F，图3G |
| 棕榈酰化检测 | alk-C16浓度（100 μM）和标记时间（8小时），点击化学试剂顺序和浓度，ABE方法中NEM、TCEP、羟胺、生物素-BMCC浓度和孵育时间 阅读提示：STAR Methods 'Click chemistry reaction for palmitoylation' 和 'Acyl-biotin exchange' |
| 蛋白互作与磷酸化 | 免疫沉淀使用的抗体和beads（FLAG M2、HA、Protein A/G），GST pull-down使用的GST融合蛋白和glutathione sepharose，λ磷酸酶处理条件（30°C, 30分钟），体外激酶缓冲液组成（ATP 125 μM, AMP 150 μM, 30°C 30分钟） 阅读提示：STAR Methods 'Immunoprecipitation', 'GST-pull down assay', 'In vitro kinase assay' |
| 亚细胞定位 | 免疫荧光固定和通透条件（4% PFA, 0.1% saponin），抗体浓度和孵育时间，共聚焦显微镜型号（Nikon A1R），亚细胞分级分离的离心步骤（720g, 10,000g, 100,000g）和缓冲液组成（蔗糖缓冲液） 阅读提示：STAR Methods 'Immunofluorescent staining' 和 'Subcellular fractionations assays' |
| 信号传导检测 | p65和p38磷酸化检测抗体（CST 3033, CST 4511），IL-6检测ELISA试剂盒（QuantiCyto，NeoBioscience），刺激时间（30分钟或7小时），统计方法（Student's t test） 阅读提示：图1, 图5, STAR Methods 'ELISA' 和 'Quantification and statistical analysis' |