冠状动脉粥样硬化性心脏病患者血清NLRP3与Treg/Th17比值的负相关性

Negative Correlation between Serum NLRP3 and the Ratio of Treg/Th17 in Patients with Obstructive Coronary Artery Disease.

作者信息ZhiXing Fan, YiFan Huang, JinChun Wu, ChaoJun Yang, Xin Guo, Linghui Du, Jian Yang
PMID39076663
发布时间2022-12-12
DOI10.31083/j.rcm2312403

实验完整度

中

研究包含患者外周血样本的流式细胞术、RT-PCR、ELISA检测及相关性分析,构成多层级实验验证,但缺乏功能或机制干预实验。

主要模型

冠心病患者外周血单个核细胞(PBMCs) 对照人群外周血单个核细胞(PBMCs)

重点核对

冠状动脉造影确诊的冠心病患者52例,对照组52例 PBMCs分离后调整浓度至2×10^6/mL 流式细胞术检测Treg(CD4+CD25+CD127-)和Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞频率 RT-PCR检测Foxp3和RORC mRNA表达,GAPDH作为内参 ELISA检测血清NLRP3、IL-10、TGF-β1、IL-1β、IL-17A、IL-23水平

摘要

背景:调节性T(Treg)细胞是一类具有抗动脉粥样硬化潜在保护作用的抗炎淋巴细胞亚群,而辅助性T细胞17(Th17)细胞据报道具有促动脉粥样硬化活性。据认为,循环中Treg/Th17失衡与动脉粥样硬化的发生和进展相关。本研究旨在探讨血清Nod样受体蛋白3(NLRP3)对动脉粥样硬化患者Treg/Th17平衡的调节作用。方法:将52例冠状动脉粥样硬化且狭窄程度超过50%的患者纳入冠心病(CAD)组,将同等数量经冠状动脉造影证实无冠状动脉粥样硬化者纳入对照组。提取并培养两组患者的外周血单个核细胞(PBMCs)。通过流式细胞术计算Treg/Th17比值并定量分析Treg和Th17细胞频率。采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测PBMCs中叉头翼状螺旋转录因子(Foxp3)和维甲酸相关孤儿核受体C(RORC)的mRNA水平。应用酶联免疫吸附试验检测血清NLRP3、白细胞介素(IL)-10、IL-1β、IL-17A、IL-23和转化生长因子(TGF)-β1的水平。此外,采用Pearson相关系数分析血清Treg/Th17比值与NLRP3水平之间的关系。结果:两组受试者的基线参数,包括性别、年龄或血液生化指标,差异无统计学意义(p > 0.05)。与对照组相比,CAD组Th17细胞频率升高,Treg细胞频率降低,Treg/Th17比值降低(p < 0.05)。与T细胞亚群比例的变化一致,动脉粥样硬化患者Th17细胞相关转录因子RORC的mRNA水平显著升高(p < 0.05),而Treg细胞相关转录因子Foxp3的mRNA表达显著降低(p < 0.05)。同样,CAD组血清NLRP3、IL-17A、IL-1和IL-23水平显著升高,而IL-10和TGF-β1降低(p < 0.05)。此外,NLRP3与Treg/Th17比值呈负相关(r = –0.69,p < 0.001)。结论:由于对血清Treg/Th17比值的潜在影响,NLRP3可能在动脉粥样硬化疾病的发生和进展中起加重作用。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
血清NLRP3是否与动脉粥样硬化患者外周血Treg/Th17平衡相关?
核心机制
NLRP3可能通过调节Treg/Th17失衡,促进炎症因子表达,从而加剧动脉粥样硬化进展。
主要证据
冠心病患者PBMCs中Th17频率升高、Treg频率降低,Foxp3 mRNA降低、RORC mRNA升高,血清NLRP3及促炎细胞因子升高、抗炎细胞因子降低,且NLRP3与Treg/Th17比值呈负相关(r=-0.699, p<0.001)。
研究意义
该发现为动脉粥样硬化的免疫机制研究、临床风险评估及防治提供了新思路。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

患者入组与分组

比较冠心病患者与对照人群的免疫指标差异

纳入经冠状动脉造影确诊的冠心病患者(CAD组)和无冠状动脉狭窄的对照者(对照组)各52例,采集空腹静脉血。

2

PBMCs分离与培养

获取外周血单个核细胞用于后续检测

采用密度梯度离心法从全血中分离PBMCs,并用PBS重悬调整浓度。

3

流式细胞术检测Treg和Th17细胞频率

定量分析Treg和Th17细胞亚群比例及Treg/Th17比值

用特异性抗体标记PBMCs,通过流式细胞仪检测Treg(CD4+CD25+CD127-)和Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞频率。

4

RT-PCR检测转录因子mRNA表达

检测Treg和Th17相关转录因子的mRNA表达水平

用TRIzol提取PBMCs总RNA,逆转录合成cDNA,进行实时定量PCR检测Foxp3和RORC mRNA表达。

5

ELISA检测血清因子水平

检测血清NLRP3及炎症因子水平

分离血清,用ELISA试剂盒检测NLRP3、IL-10、TGF-β1、IL-1β、IL-17A、IL-23的浓度。

6

相关性与统计分析

分析血清NLRP3水平与Treg/Th17比值的关系

使用Pearson相关系数分析NLRP3与Treg/Th17比值的相关性,并比较两组间各项指标差异。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

验证样本或模型特征
验证细胞功能变化

产品清单

实验环节名称品牌货号
抗人CD4 FITC抗体Ebioscience85-11-0047-42
抗人CD25 PE抗体Ebioscience85-12-0259-42
抗人CD127-PE-CY7抗体Ebioscience85-25-1278-42
抗人CD3 FITC抗体Ebioscience11-0039-42
抗人CD8 APC抗体Ebioscience17-0088-42
抗人IL-17A-PE抗体Ebioscience12-7178-42
佛波醇乙酯Sigmap1585
离子霉素Sigma407951
莫能霉素Solarbiom8670
布雷菲德菌素ASigmab5936
流式细胞仪Beckman Kurt TechnologyCytoFLEX
TRIzol试剂----
cDNA合成试剂盒Sigma--
SYBR预混试剂盒Takara--
NLRP3 ELISA试剂盒Wuhan Feien Biotechnologyeh4202
IL-10 ELISA试剂盒Xinbosheng Biotechnologyehc009.96
TGF-β1 ELISA试剂盒Xixinbosheng Biotechnologyehc107b.96
IL-1β ELISA试剂盒Wuhan Feien Biotechnologyeh0185
IL-23 ELISA试剂盒Xixinbosheng Biotechnologyehc171.96
IL-17A ELISA试剂盒Xixinbosheng Biotechnologyehc170.96

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
患者入组与分组
纳入标准(冠状动脉狭窄≥50%)、排除标准、样本量(每组52例)、基线特征(性别、年龄、血液生化指标)
阅读提示:详见Methods 2.1 Participated Patients 和 Table 1
PBMCs分离与培养
密度梯度离心方法、PBMCs浓度(2×10^6/mL)、PBS用量
阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第一段
流式细胞术检测Treg和Th17
抗体克隆号及荧光标记、Treg标记方案(CD4+CD25+CD127-)、Th17刺激条件(PMA浓度25 ng/mL、离子霉素1 μg/mL、莫能霉素1.4 μg/mL、布雷菲德菌素A 3 μg/mL、刺激时间6小时)、Th17标记方案(CD3+CD8-IL-17+)、流式细胞仪型号
阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第二段
RT-PCR检测转录因子
RNA提取方法(TRIzol)、逆转录试剂盒、SYBR试剂盒、反应条件(95°C 2min,95°C 15s→60°C 30s→72°C 30s,40循环)、内参基因(GAPDH)、引物序列、数据分析方法(2-ΔΔCt)
阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第三段及 Table 2
ELISA检测血清因子
血清分离条件(3000 r/min离心20分钟)、ELISA试剂盒品牌及货号
阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第四段
统计分析
统计软件(SPSS 22)、t检验、χ2检验、Pearson相关分析、p值阈值(<0.05)
阅读提示:详见Methods 2.3 Statistical Analysis