患者入组与分组
比较冠心病患者与对照人群的免疫指标差异
纳入经冠状动脉造影确诊的冠心病患者(CAD组)和无冠状动脉狭窄的对照者(对照组)各52例,采集空腹静脉血。
Negative Correlation between Serum NLRP3 and the Ratio of Treg/Th17 in Patients with Obstructive Coronary Artery Disease.
研究包含患者外周血样本的流式细胞术、RT-PCR、ELISA检测及相关性分析,构成多层级实验验证,但缺乏功能或机制干预实验。
冠心病患者外周血单个核细胞(PBMCs) 对照人群外周血单个核细胞(PBMCs)
冠状动脉造影确诊的冠心病患者52例,对照组52例 PBMCs分离后调整浓度至2×10^6/mL 流式细胞术检测Treg(CD4+CD25+CD127-)和Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞频率 RT-PCR检测Foxp3和RORC mRNA表达,GAPDH作为内参 ELISA检测血清NLRP3、IL-10、TGF-β1、IL-1β、IL-17A、IL-23水平
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
比较冠心病患者与对照人群的免疫指标差异
纳入经冠状动脉造影确诊的冠心病患者(CAD组)和无冠状动脉狭窄的对照者(对照组)各52例,采集空腹静脉血。
获取外周血单个核细胞用于后续检测
采用密度梯度离心法从全血中分离PBMCs,并用PBS重悬调整浓度。
定量分析Treg和Th17细胞亚群比例及Treg/Th17比值
用特异性抗体标记PBMCs,通过流式细胞仪检测Treg(CD4+CD25+CD127-)和Th17(CD3+CD8-IL-17+)细胞频率。
检测Treg和Th17相关转录因子的mRNA表达水平
用TRIzol提取PBMCs总RNA,逆转录合成cDNA,进行实时定量PCR检测Foxp3和RORC mRNA表达。
检测血清NLRP3及炎症因子水平
分离血清,用ELISA试剂盒检测NLRP3、IL-10、TGF-β1、IL-1β、IL-17A、IL-23的浓度。
分析血清NLRP3水平与Treg/Th17比值的关系
使用Pearson相关系数分析NLRP3与Treg/Th17比值的相关性,并比较两组间各项指标差异。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 流式细胞术 | 抗人CD4 FITC抗体 | Ebioscience | 85-11-0047-42 |
| 抗人CD25 PE抗体 | Ebioscience | 85-12-0259-42 | |
| 抗人CD127-PE-CY7抗体 | Ebioscience | 85-25-1278-42 | |
| 抗人CD3 FITC抗体 | Ebioscience | 11-0039-42 | |
| 抗人CD8 APC抗体 | Ebioscience | 17-0088-42 | |
| 抗人IL-17A-PE抗体 | Ebioscience | 12-7178-42 | |
| 细胞培养 | 佛波醇乙酯 | Sigma | p1585 |
| 离子霉素 | Sigma | 407951 | |
| 莫能霉素 | Solarbio | m8670 | |
| 布雷菲德菌素A | Sigma | b5936 | |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | Beckman Kurt Technology | CytoFLEX |
| RT-PCR | TRIzol试剂 | -- | -- |
| cDNA合成试剂盒 | Sigma | -- | |
| SYBR预混试剂盒 | Takara | -- | |
| ELISA | NLRP3 ELISA试剂盒 | Wuhan Feien Biotechnology | eh4202 |
| IL-10 ELISA试剂盒 | Xinbosheng Biotechnology | ehc009.96 | |
| TGF-β1 ELISA试剂盒 | Xixinbosheng Biotechnology | ehc107b.96 | |
| IL-1β ELISA试剂盒 | Wuhan Feien Biotechnology | eh0185 | |
| IL-23 ELISA试剂盒 | Xixinbosheng Biotechnology | ehc171.96 | |
| IL-17A ELISA试剂盒 | Xixinbosheng Biotechnology | ehc170.96 |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 患者入组与分组 | 纳入标准(冠状动脉狭窄≥50%)、排除标准、样本量(每组52例)、基线特征(性别、年龄、血液生化指标) 阅读提示:详见Methods 2.1 Participated Patients 和 Table 1 |
| PBMCs分离与培养 | 密度梯度离心方法、PBMCs浓度(2×10^6/mL)、PBS用量 阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第一段 |
| 流式细胞术检测Treg和Th17 | 抗体克隆号及荧光标记、Treg标记方案(CD4+CD25+CD127-)、Th17刺激条件(PMA浓度25 ng/mL、离子霉素1 μg/mL、莫能霉素1.4 μg/mL、布雷菲德菌素A 3 μg/mL、刺激时间6小时)、Th17标记方案(CD3+CD8-IL-17+)、流式细胞仪型号 阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第二段 |
| RT-PCR检测转录因子 | RNA提取方法(TRIzol)、逆转录试剂盒、SYBR试剂盒、反应条件(95°C 2min,95°C 15s→60°C 30s→72°C 30s,40循环)、内参基因(GAPDH)、引物序列、数据分析方法(2-ΔΔCt) 阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第三段及 Table 2 |
| ELISA检测血清因子 | 血清分离条件(3000 r/min离心20分钟)、ELISA试剂盒品牌及货号 阅读提示:详见Methods 2.2 Measurement 第四段 |
| 统计分析 | 统计软件(SPSS 22)、t检验、χ2检验、Pearson相关分析、p值阈值(<0.05) 阅读提示:详见Methods 2.3 Statistical Analysis |