DENV-2 365株的特性分析
比较DENV-2 365株与NGC株在体外的复制和致病性差异，以评估其用于动物模型的潜力。
在BHK细胞中以MOI 0.01感染DENV-2 NGC和365株，收集1-6 dpi上清进行空斑实验，观察空斑形态。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
用于诱变研究的致死性DENV-2野生型小鼠模型
A lethal DENV-2 wild-type mouse model for mutagenesis investigations.
实验完整度
高建立了野生型小鼠模型，包含体外细胞实验（BHK、HBMEC、HUVEC）、体内动物实验（C57BL/6小鼠）及分子机制验证（qPCR、ELISA、病理学），并进行突变体功能验证。
主要模型
C57BL/6野生型小鼠 BHK细胞 HBMECs HUVECs
重点核对
小鼠周龄：3周龄 抗体阻断剂量：2.5 mg抗IFN-α/β受体单克隆抗体 病毒攻击剂量：1×10^7 PFU，尾静脉注射 检测时间点：病毒血症1-11 dpi，细胞因子6 dpi，血管渗漏6 dpi，病理10 dpi或人道终点 细胞感染MOI：0.1（HBMEC/HUVEC）
摘要
背景：有效的抗病毒药物测试小鼠模型应成本低廉且劳动强度低。免疫缺陷小鼠模型，如AG129，常用于登革病毒（DENV）研究；但其进口和维护成本高，使其相对昂贵。此外，缺乏IFN-γ信号限制了AG129模型的能力。迄今为止，DENV感染的野生型小鼠模型仅表现出轻微症状而无致死性，限制了其研究适用性。在本研究中，我们开发了一种感染DENV-2 365株的致死性C57BL/6野生型小鼠模型。通过在病毒攻击前阻断I型干扰素受体，我们允许免疫反应在感染后期恢复。结果：感染后，小鼠表现出严重症状，包括体重减轻、高病毒血症水平、炎性细胞因子升高、显著的血管渗漏以及脑、肾、肝和脾的病理变化。该模型还表现出严重的中枢神经系统症状和100%的死亡率。此外，我们利用该模型评估了在寨卡病毒和DENV-2中发现的适应性NS2A蛋白突变。结论：我们的研究介绍了一种用于研究病毒突变的替代模型设计，为未来的研究提供了宝贵的工具。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 能否建立一种成本效益高、保留IFN-γ信号的致死性野生型小鼠模型，用于研究DENV感染和病毒突变？
- 核心机制
- NS2A蛋白第55位（DENV-2）或56位（ZIKV）的精氨酸（R）突变为赖氨酸（K）可降低宿主免疫反应（如ISG15、IFNB1、DDX58、IFIT1、TNF-α、IL-6的表达），从而延长病毒血症期并促进病毒存活。
- 主要证据
- 在IFNAR1阻断的C57BL/6小鼠模型中，DENV-2 365株感染导致100%死亡率、体重下降、高病毒血症、细胞因子升高、血管渗漏和病理变化；在HBMEC和HUVEC细胞中，NS2A R55K突变降低免疫因子转录水平；在体内，突变病毒株延长了生存期和病毒血症持续时间。
- 研究意义
- 该野生型小鼠模型克服了免疫缺陷小鼠低生育力和高成本的问题，保留了IFN-γ反应，且可在感染后期恢复IFN-α/β免疫反应，适用于抗病毒药物测试和病毒突变研究。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建IFNAR1阻断的野生型小鼠模型
建立致死性DENV-2感染小鼠模型，模拟人类严重登革热症状。
3周龄C57BL/6小鼠腹腔注射2.5 mg抗IFN-α/β受体单克隆抗体，24小时后尾静脉注射1×10^7 PFU DENV-2 NGC或365株。监测体重、死亡率、症状。
检测病毒血症、细胞因子和血管渗漏
评估模型中病毒复制水平、炎症反应和血管损伤，以反映疾病严重程度。
每日采集血液分离血清，qRT-PCR定量NS5基因拷贝数；6 dpi用ELISA检测TNF-α和IL-6水平；静脉注射伊文思蓝染料评估血管渗漏。
组织病理学分析
观察多器官的病理损伤，进一步验证模型的重症表现。
在10 dpi或人道终点时，收集肝、脑、脾、肾组织，固定、包埋、切片、染色，进行组织病理学检查。
构建NS2A突变病毒并进行体外验证
评估NS2A R55K（DENV-2）和R56K（ZIKV）突变对宿主免疫反应的影响。
通过定点突变构建突变病毒，感染HBMEC和HUVEC（MOI=0.1），在6、24、48 hpi提取RNA，qPCR检测ISG15、IFNB1、DDX58、IFIT1、TNF-α、IL-6转录水平。
体内验证NS2A突变的影响
在动物模型中验证突变对病毒血症周期、生存率和炎症因子的影响。
将四种病毒（DENV-2 NS2A WT/R55K，ZIKV NS2A WT/K56R）以1×10^7 PFU经尾静脉注射到mAb阻断的小鼠中，监测生存率、体重、病毒血症和TNF-α/IL-6水平。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
病毒定量
细胞因子检测
血管渗漏检测
组织病理学分析
分子克隆与突变
基因表达分析
系统发育分析
蛋白结构预测
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | RPMI-1640培养基 | Biological Industries | -- |
| DMEM培养基 | Biological Industries | -- | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | -- | |
| 青霉素-链霉素-两性霉素B溶液 | Biological Industries | -- | |
| 病毒定量 | E.Z.N.A.®病毒RNA提取试剂盒 | Omega Bio-Tek | -- |
| SteadyPure通用RNA提取试剂盒 | Accurate Biology | -- | |
| Evo M-MLV逆转录预混液 | Accurate Biology | -- | |
| Pro Taq HS探针预混液 | Accurate Biology | -- | |
| 动物实验 | 抗小鼠IFN-α/β受体单克隆抗体 | Leinco Technologies | -- |
| 细胞因子检测 | QuantiCyto®小鼠TNF-α/IL-6 ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| 血管渗漏检测 | 伊文思蓝染料 | -- | -- |
| 分子克隆 | pWSK29质粒 | -- | -- |
| In-Fusion®组装试剂盒 | Takara Bio | -- | |
| Q5热启动高保真2X预混液 | New England BioLabs | -- | |
| MEGAclear™试剂盒 | Life Technologies | -- | |
| Gene PuLser电穿孔缓冲液 | Bio-Rad | -- | |
| 4mm电穿孔杯 | Bio-Rad | -- | |
| 定点突变 | Q5®定点突变试剂盒 | New England BioLabs | -- |
| 基因表达分析 | SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR试剂盒 | Accurate Biology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系：HBMECs、HUVECs、BHK、C6/36、Vero；培养基：RPMI-1640或DMEM；添加10%FBS、1%青霉素-链霉素-两性霉素B。 阅读提示：Methods - Cells and viruses |
| 病毒定量 | 空斑实验的细胞（BHK）、吸附时间（2小时）、覆盖物（1.2%甲基纤维素）、计数时间（7 dpi）；qRT-PCR引物序列、标准曲线。 阅读提示：Methods - Virus quantification |
| 动物模型建立 | 小鼠周龄（3周）、抗体剂量（2.5 mg）、病毒剂量（1×10^7 PFU）、感染途径（尾静脉注射）、监测时间（1-10 dpi）。 阅读提示：Methods - Construction of DENV-2 and ZIKV-infected mouse models |
| 细胞因子检测 | 检测时间点（6 dpi）、ELISA试剂盒（QuantiCyto® Mouse TNF-α/IL-6 ELISA kit）。 阅读提示：Methods - Construction of DENV-2 and ZIKV-infected mouse models |
| 血管渗漏检测 | 伊文思蓝染料剂量（1 mg）、注射时间（6 dpi）、染料循环时间（2小时）、灌注PBS体积（50 mL）、组织孵育液（N,N-二甲基甲酰胺）、OD610测量。 阅读提示：Methods - Construction of DENV-2 and ZIKV-infected mouse models |
| 组织病理学分析 | 取材时间（10 dpi或人道终点）、组织（肝、脑、脾、肾）、固定液（10%缓冲福尔马林）。 阅读提示：Methods - Construction of DENV-2 and ZIKV-infected mouse models |
| 体外突变验证 | 细胞（HBMECs和HUVECs）、MOI（0.1）、时间点（6、24、48 hpi）、检测基因（ISG15、IFNB1、DDX58、IFIT1、TNF-α、IL-6）。 阅读提示：Methods - Single-site mutation analysis of ZIKV and DENV-2 |
| 体内突变验证 | 病毒剂量（1×10^7 PFU）、感染途径（尾静脉注射）、监测指标（生存率、体重、病毒血症、TNF-α/IL-6）。 阅读提示：Methods - Single-site mutation analysis of ZIKV and DENV-2 |