A subunit vaccine Ag85A-LpqH focusing on humoral immunity provides substantial protection against tuberculosis in mice.
文献包含体外蛋白表达纯化、两种小鼠感染模型、血清转移模型、细胞免疫与体液免疫检测、BCR/TCR测序等功能和机制验证。
预防模型中C57BL/6J小鼠 BCG初免-加强模型中C57BL/6J小鼠 Raw264.7巨噬细胞
预防模型和BCG初免-加强模型的建立，使用C57BL/6J雌性小鼠（6-8周龄） 疫苗免疫方案：皮下注射20 μg融合蛋白AL分别与1 mg铝佐剂或50 μg Poly IC佐剂混合，共免疫3次，间隔2周 攻毒菌株和剂量：毒力牛分枝杆菌C68004经鼻攻毒200 CFU（慢性感染模型） 血清转移实验：每只小鼠腹腔注射300 μL免疫血清，5小时后经鼻感染300 CFU M. bovis 主要检测指标：肺和脾脏细菌载量（CFU）、肺脏病理评分、ELISA抗体滴度、流式细胞术分析T/B细胞亚群
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
制备高纯度、低内毒素的Ag85A-LpqH融合蛋白用于后续免疫实验。
以MTB H37Rv基因组为模板，通过SOE PCR扩增Ag85A和LpqH基因并连接（linker (GGGGS)3），克隆至pET-21a(+)载体，转化BL21(DE3)表达。以包涵体形式表达，经Ni-agarose纯化、梯度尿素透析复性。通过SDS-PAGE和Western Blot鉴定，TAL法检测内毒素，BCA法测定蛋白浓度。
评估Ag85A-LpqH疫苗在不同免疫方案下的保护效力。
预防模型中，小鼠皮下免疫ALA（AL+铝佐剂）或ALP（AL+Poly IC佐剂）三次，间隔两周，对照组给予BCG或PBS。初免-加强模型中，先BCG初免，4周后用AL或ALP皮下加强免疫三次。免疫完成后用毒力M. bovis经鼻攻毒。
评价疫苗对M. bovis感染的保护效果。
攻毒后处死小鼠，取肺和脾脏匀浆，稀释涂板于7H10琼脂，培养4周后计数CFU。肺组织固定、包埋、HE染色，通过病理评分（0-5级）评估肺损伤程度。
检测疫苗诱导的血清抗体滴度和亚型。
每次免疫后2周和感染后4周采集小鼠尾静脉血，分离血清。以热灭活M. bovis包被ELISA板，用1:3000稀释的血清作为一抗，检测IgG、IgG1、IgG2c、IgG3、IgM和IgA抗体。
检测疫苗诱导的T细胞免疫应答。
免疫结束后取小鼠脾脏和淋巴结制备单细胞悬液，用特异性抗原（AL蛋白或BCG裂解物）刺激12小时，收集上清检测细胞因子（IFN-γ等），细胞沉淀用于流式细胞术分析CD3、CD4、CD8 T细胞亚群。并分离骨髓细胞诱导BMDC，检测成熟标志，与脾淋巴细胞共培养评估抗原呈递功能。
评估免疫血清对巨噬细胞吞噬分枝杆菌的影响。
将FITC标记的BCG与Raw264.7细胞以MOI=5:1在含10%小鼠血清的DMEM中共培养2小时，通过流式细胞术和CFU计数评估吞噬效率。
验证疫苗诱导的血清抗体是否具有被动保护作用。
收集预防模型中免疫小鼠（ALA、BCG、PBS）的血清，腹腔注射300 μL给受体小鼠，5小时后经鼻感染300 CFU M. bovis，感染2周后处死，评估肺脾细菌载量和肺病理。
分析免疫后小鼠B细胞受体和T细胞受体组库变化。
从免疫后小鼠脾脏提取RNA，进行BCR和TCR测序（ImmuHub系统，Illumina NovaSeq），分析CDR3多样性、V/J基因使用及抗体重链亚型分布。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细菌培养 | Middlebrook 7H9肉汤 | BD | Cat# 271310 |
| Middlebrook 7H10肉汤 | BD | Cat# 262710 | |
| OADC增菌液 | BD | Cat# 211886 | |
| 吐温80 | Amresco | Cat# 0442 | |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | Cat# C11995500BT |
| 胎牛血清 | Eallbio | Cat# A16001DC | |
| 青霉素/链霉素双抗 | Solarbio | Cat# P1400 | |
| 流式细胞术 | 异硫氰酸荧光素 | Solarbio | Cat# F8070 |
| 山羊抗小鼠IgG二抗（HRP） | Abcam | ab205719 | |
| PE标记的抗小鼠CD3抗体 | Biolegend | 100205 | |
| FITC标记的抗小鼠CD4抗体 | Biolegend | 100405 | |
| APC标记的抗小鼠CD8α抗体 | Biolegend | 100711 | |
| PerCp-Cyanine5.5标记的抗小鼠CD8α抗体 | Biolegend | 100733 | |
| FITC标记的抗小鼠CD11c抗体 | Biolegend | 117306 | |
| APC标记的抗小鼠CD80抗体 | Biolegend | 104713 | |
| PE标记的抗小鼠CD86抗体 | Biolegend | 159203 | |
| APC-Cyanine7标记的抗I-A/I-E抗体 | Biolegend | 107627 | |
| ELISA | TMB单组分底物溶液 | Solarbio | PR1200 |
| 96孔Maxisorp酶标板 | Thermo | 442404 | |
| 巨噬细胞吞噬实验 | BD FACSCalibur流式细胞仪 | BD | -- |
| 细胞因子检测 | 小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC101g.96 |
| 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC102a.96 | |
| 小鼠IL-2 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC002.96 | |
| 小鼠IL-17/IL-17A ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC008.96 | |
| 小鼠IL-10 ELISA试剂盒 | Neobioscience | EMC005.96 | |
| 重组蛋白表达 | PrimeSTAR HS DNA聚合酶 | Takara | R044Q |
| 蛋白纯化 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | 23227 |
| 动物实验 | Imject铝佐剂 | Thermo | 77161 |
| 组织病理 | VENTANA DP 200玻片扫描仪 | Roche | -- |
| 细胞分离 | 小鼠CD11c微珠超纯 | Miltenyi | 130-125-835 |
| RNA提取 | RNeasy Plus Mini试剂盒 | Qiagen | -- |
| 测序 | Illumina NovaSeq测序平台 | Illumina | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 疫苗制备 | Ag85A-LpqH融合蛋白的表达和纯化条件（如诱导温度、IPTG浓度、纯化缓冲液等） 阅读提示：STAR★Methods：Preparation of the Ag85A-LpqH |
| 小鼠免疫模型 | 预防和初免-加强模型的免疫方案（包括疫苗剂量、佐剂种类、免疫次数、间隔、BCG初免剂量和途径） 阅读提示：STAR★Methods：Mouse challenge models |
| 攻毒感染 | 攻毒菌株（M. bovis C68004）、攻毒途径（鼻内）、攻毒剂量（200 CFU） 阅读提示：STAR★Methods：Mouse challenge models |
| 细菌载量评估 | 肺和脾脏匀浆、稀释涂板培养基（7H10含OADC和抗生素）、培养条件（37°C两周）、CFU计数 阅读提示：STAR★Methods：细菌载量评估 |
| 体液免疫检测 | ELISA的包被抗原（热灭活M. bovis）、血清稀释度（1:3000）、二抗浓度（1:20000）、孵育时间和温度 阅读提示：STAR★Methods：Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) |
| 细胞免疫检测 | 脾淋巴细胞制备、刺激物（10 μg/mL AL或BCG裂解物）、刺激时间（12 h）、细胞因子检测试剂盒 阅读提示：STAR★Methods：Cytokines detection assay |
| 流式细胞术 | 抗体克隆号、染色时间、温度、洗涤、固定（4% PFA） 阅读提示：STAR★Methods：Cell analysis by flow cytometry |
| 巨噬细胞吞噬实验 | Raw264.7细胞系、MOI=5:1、血清浓度（10%）、共培养时间（2 h） 阅读提示：STAR★Methods：Macrophage phagocytosis assay |
| 血清转移实验 | 血清注射剂量（300 μL）、攻毒时间（5小时后）、攻毒剂量（300 CFU） 阅读提示：STAR★Methods：Mouse challenge models (血清转移模型) |
| BCR/TCR测序 | RNA提取试剂盒、测序平台（Illumina NovaSeq）、分析软件（VDJtools）、样本量（每组n=2-3） 阅读提示：STAR★Methods：BCR and TCR repertoires sequencing and analysis |
