建立脓毒症诱导的急性肝损伤模型及运动训练干预
验证运动训练对CLP诱导的脓毒症小鼠肝损伤的保护作用
将C57BL/6J小鼠随机分为运动组和对照组,运动组进行为期14天的跑步机训练,随后通过CLP诱导脓毒症。检测生存率、血清ALT/AST、肝脏组织学、细胞死亡和炎症因子水平。
Gut microbe-derived betulinic acid alleviates sepsis-induced acute liver injury by inhibiting macrophage NLRP3 inflammasome in mice.
包含动物模型(CLP诱导的脓毒症)、粪便菌群移植、抗生素耗竭、多组学分析(16S rRNA、代谢组、转录组)、体外BMDM功能实验及机制验证(SPR、CETSA、siRNA敲低)等。
C57BL/6J小鼠CLP诱导的脓毒症模型 骨髓来源巨噬细胞(BMDM) 粪菌移植小鼠模型
运动训练方案:每天1小时,持续14天 CLP诱导脓毒症:18G针头穿刺盲肠两次 抗生素混合物(ABX)消耗肠道菌群:连续5天口服万古霉素、新霉素、甲硝唑、氨苄青霉素 BA处理:20或40 mg/kg口服,在CLP前2小时给药 BMDM刺激条件:LPS(3小时)加ATP(5 mM, 30分钟)
提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
验证运动训练对CLP诱导的脓毒症小鼠肝损伤的保护作用
将C57BL/6J小鼠随机分为运动组和对照组,运动组进行为期14天的跑步机训练,随后通过CLP诱导脓毒症。检测生存率、血清ALT/AST、肝脏组织学、细胞死亡和炎症因子水平。
确定运动训练的保护作用是否依赖于肠道菌群
对运动组和对照组小鼠在CLP前给予抗生素混合物(ABX)5天以消耗肠道菌群,然后诱导CLP,比较生存率、肝损伤指标和炎症反应。
评估运动训练相关的肠道菌群是否足以赋予保护作用
收集运动组和对照组小鼠的粪便,制备菌液后灌胃给受体小鼠(预先用ABX消耗肠道菌群),随后进行CLP,比较两组受体小鼠的生存率和肝损伤情况。
分析运动训练引起的肠道菌群组成和代谢物变化
收集运动组和对照组小鼠的粪便,进行16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学分析,鉴定差异菌群和代谢物,并通过LC-MS/MS验证桦木酸(BA)在粪便和肝脏中的水平。
验证Ligilactobacillus能否产生BA
将小鼠食物与PBS混合,接种L. salivarius 37°C厌氧培养24小时,检测培养基中BA浓度。
验证BA是否能改善脓毒症小鼠的肝损伤和全身炎症
在CLP前2小时给小鼠口服BA(20或40 mg/kg),然后诱导CLP,评估生存率、肝损伤指标、细胞死亡和炎症因子。
验证BA是否抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活
使用LPS和ATP刺激BMDMs,或加BA预处理,检测炎症因子表达、NLRP3炎症小体相关蛋白水平、ASC寡聚化、IL-1β和LDH释放。
鉴定BA的分子靶点并验证其相互作用
通过SPR-LC-MS/MS筛选BA结合蛋白,鉴定hnRNPA2B1;通过分子对接、SPR、CETSA验证交互作用;通过siRNA敲低hnRNPA2B1验证其在NLRP3炎症小体激活中的功能。
按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 动物模型 | 桦木酸 | MedChemExpress | HY-10529 |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | 15140-122 | |
| 巨噬细胞集落刺激因子 | R&D Systems | 416 mL | |
| 细菌培养 | MRS培养基 | HKM | -- |
| 生化和细胞因子检测 | ALT/AST检测试剂盒 | JianCheng | -- |
| IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- | |
| 组织学 | TUNEL试剂盒 | Beyotime Biotechnology | -- |
| CD68抗体 | Servicebio | -- | |
| 生物素化山羊抗兔IgG | Gene Tech | -- | |
| 代谢组学 | 超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱 | Thermo Scientific | -- |
| Western blot | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo | 23225 |
| NLRP3单克隆抗体 | Cell Signaling Technology | 15101 | |
| hnRNPA2B1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53620 | |
| ASC抗体 | Cell Signaling Technology | 67824 | |
| 脂质体RNAiMAX转染试剂 | Invigentech | 13778150 | |
| SPR | PlexArray HT系统 | Plexera | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 动物模型及运动训练 | 运动训练方案:每天1小时,持续14天;CLP手术操作细节 阅读提示:Materials and Methods, Animal models |
| 肠道菌群耗竭与粪菌移植 | ABX抗生素组合及剂量;粪菌移植的供体来源、剂量、途径和频率 阅读提示:Materials and Methods, Fecal microbiota transplantation |
| BA给药 | BA剂量(20或40 mg/kg)、给药途径(口服)和时间(CLP前2小时) 阅读提示:Materials and Methods, Animal models; Figure 4 legend |
| 体外巨噬细胞实验 | BMDM分化条件;BA浓度(10或20 µM);LPS刺激时间(3小时);ATP浓度(5 mM)和刺激时间(30分钟) 阅读提示:Materials and Methods, Cell and bacterial culture; Figure 5 legend |
| 机制实验(靶点验证) | SPR实验的芯片类型、固定方法及BA浓度梯度;CETSA的温度范围;siRNA转染序列和条件 阅读提示:Materials and Methods, SPR-LC-MS/MS assay, Surface plasmon resonance, Cellular thermal shift assay, Transient transfection |