肠道微生物来源的桦木酸通过抑制小鼠巨噬细胞NLRP3炎症小体减轻脓毒症诱导的急性肝损伤

Gut microbe-derived betulinic acid alleviates sepsis-induced acute liver injury by inhibiting macrophage NLRP3 inflammasome in mice.

作者信息Xuheng Tang, Tairan Zeng, Wenyan Deng, Wanning Zhao, Yanan Liu, Qiaobing Huang, Yiyu Deng, Weidang Xie, Wei Huang
PMID39887250
期刊mBio
发布时间2025-03-12
DOI10.1128/mbio.03020-24

实验完整度

包含动物模型(CLP诱导的脓毒症)、粪便菌群移植、抗生素耗竭、多组学分析(16S rRNA、代谢组、转录组)、体外BMDM功能实验及机制验证(SPR、CETSA、siRNA敲低)等。

主要模型

C57BL/6J小鼠CLP诱导的脓毒症模型 骨髓来源巨噬细胞(BMDM) 粪菌移植小鼠模型

重点核对

运动训练方案:每天1小时,持续14天 CLP诱导脓毒症:18G针头穿刺盲肠两次 抗生素混合物(ABX)消耗肠道菌群:连续5天口服万古霉素、新霉素、甲硝唑、氨苄青霉素 BA处理:20或40 mg/kg口服,在CLP前2小时给药 BMDM刺激条件:LPS(3小时)加ATP(5 mM, 30分钟)

摘要

脓毒症诱导的急性肝损伤(SALI)是与脓毒症相关的常见且危及生命的并发症。肠道微生物群在维持健康和疾病发展中起着至关重要的作用。运动对肠道微生物群调节的影响已被充分记录。然而,肠道微生物组对运动训练诱导的SALI保护作用的潜在影响仍不确定。在这里,我们发现运动训练改善了脓毒症小鼠的SALI和全身炎症。值得注意的是,肠道微生物预耗竭消除了运动训练在SALI小鼠中的保护作用。粪便微生物群移植治疗显示,运动训练相关的肠道微生物群有助于运动训练对SALI的有益作用。运动训练调节了Ligilactobacillus的代谢,并富集了小鼠体内的桦木酸(BA)水平。在功能上,BA治疗通过抑制小鼠肝脏炎症反应赋予对SALI的保护作用。BA结合并失活hnRNPA2B1,从而抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活。总的来说,这项研究揭示了肠道微生物群参与运动训练对SALI的保护作用,肠道微生物群来源的BA通过hnRNPA2B1-NLRP3轴抑制肝脏炎症反应,为SALI提供了潜在的治疗策略。

实验结论

提炼研究问题、关键发现与证据,快速把握文章的核心贡献。

研究问题
肠道菌群是否介导运动训练对脓毒症诱导的急性肝损伤(SALI)的保护作用,以及其分子机制是什么?
核心机制
运动训练通过调节肠道菌群,增加Ligilactobacillus丰度,并促进其代谢产物桦木酸(BA)的产生;BA直接结合hnRNPA2B1并抑制其活性,进而抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活,从而减轻肝损伤。
主要证据
在CLP诱导的败血症小鼠中,运动训练改善了SALI,而抗生素消耗肠道菌群或粪便菌群移植实验表明菌群是必需的。16S rRNA测序和代谢组学显示Ligilactobacillus和BA增多。体外BMDM实验表明BA抑制LPS+ATP诱导的NLRP3炎症小体激活,并通过SPR、CETSA和siRNA敲低验证了hnRNPA2B1作为直接靶点。
研究意义
该研究为调节肠道微生物组作为脓毒症临床管理的治疗策略提供了重要一步,并提示靶向hnRNPA2B1可能为SALI提供治疗潜力。

研究路径

按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。

1

建立脓毒症诱导的急性肝损伤模型及运动训练干预

验证运动训练对CLP诱导的脓毒症小鼠肝损伤的保护作用

将C57BL/6J小鼠随机分为运动组和对照组,运动组进行为期14天的跑步机训练,随后通过CLP诱导脓毒症。检测生存率、血清ALT/AST、肝脏组织学、细胞死亡和炎症因子水平。

2

验证肠道菌群在运动训练保护作用中的必要性

确定运动训练的保护作用是否依赖于肠道菌群

对运动组和对照组小鼠在CLP前给予抗生素混合物(ABX)5天以消耗肠道菌群,然后诱导CLP,比较生存率、肝损伤指标和炎症反应。

3

粪便菌群移植证实运动相关菌群的保护作用

评估运动训练相关的肠道菌群是否足以赋予保护作用

收集运动组和对照组小鼠的粪便,制备菌液后灌胃给受体小鼠(预先用ABX消耗肠道菌群),随后进行CLP,比较两组受体小鼠的生存率和肝损伤情况。

4

肠道菌群与代谢物分析及关键代谢物鉴定

分析运动训练引起的肠道菌群组成和代谢物变化

收集运动组和对照组小鼠的粪便,进行16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学分析,鉴定差异菌群和代谢物,并通过LC-MS/MS验证桦木酸(BA)在粪便和肝脏中的水平。

5

体外验证Ligilactobacillus产生BA

验证Ligilactobacillus能否产生BA

将小鼠食物与PBS混合,接种L. salivarius 37°C厌氧培养24小时,检测培养基中BA浓度。

6

BA对脓毒症小鼠肝损伤的治疗作用

验证BA是否能改善脓毒症小鼠的肝损伤和全身炎症

在CLP前2小时给小鼠口服BA(20或40 mg/kg),然后诱导CLP,评估生存率、肝损伤指标、细胞死亡和炎症因子。

7

体外验证BA对巨噬细胞NLRP3炎症小体激活的抑制作用

验证BA是否抑制巨噬细胞中NLRP3炎症小体的激活

使用LPS和ATP刺激BMDMs,或加BA预处理,检测炎症因子表达、NLRP3炎症小体相关蛋白水平、ASC寡聚化、IL-1β和LDH释放。

8

鉴定并验证BA的靶点hnRNPA2B1

鉴定BA的分子靶点并验证其相互作用

通过SPR-LC-MS/MS筛选BA结合蛋白,鉴定hnRNPA2B1;通过分子对接、SPR、CETSA验证交互作用;通过siRNA敲低hnRNPA2B1验证其在NLRP3炎症小体激活中的功能。

研究方法

按研究目的归类文中使用的方法,便于定位所需技术。

产品清单

实验环节名称品牌货号
桦木酸MedChemExpressHY-10529
DMEM培养基Gibco--
青霉素-链霉素Gibco15140-122
巨噬细胞集落刺激因子R&D Systems416 mL
MRS培养基HKM--
ALT/AST检测试剂盒JianCheng--
IL-1β、TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒NeoBioscience--
TUNEL试剂盒Beyotime Biotechnology--
CD68抗体Servicebio--
生物素化山羊抗兔IgGGene Tech--
超高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱质谱Thermo Scientific--
BCA蛋白定量试剂盒Thermo23225
NLRP3单克隆抗体Cell Signaling Technology15101
hnRNPA2B1抗体Santa Cruz Biotechnologysc-53620
ASC抗体Cell Signaling Technology67824
脂质体RNAiMAX转染试剂Invigentech13778150
PlexArray HT系统Plexera--

关键环节

汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。

环节核对要点
动物模型及运动训练
运动训练方案:每天1小时,持续14天;CLP手术操作细节
阅读提示:Materials and Methods, Animal models
肠道菌群耗竭与粪菌移植
ABX抗生素组合及剂量;粪菌移植的供体来源、剂量、途径和频率
阅读提示:Materials and Methods, Fecal microbiota transplantation
BA给药
BA剂量(20或40 mg/kg)、给药途径(口服)和时间(CLP前2小时)
阅读提示:Materials and Methods, Animal models; Figure 4 legend
体外巨噬细胞实验
BMDM分化条件;BA浓度(10或20 µM);LPS刺激时间(3小时);ATP浓度(5 mM)和刺激时间(30分钟)
阅读提示:Materials and Methods, Cell and bacterial culture; Figure 5 legend
机制实验(靶点验证)
SPR实验的芯片类型、固定方法及BA浓度梯度;CETSA的温度范围;siRNA转染序列和条件
阅读提示:Materials and Methods, SPR-LC-MS/MS assay, Surface plasmon resonance, Cellular thermal shift assay, Transient transfection