体外抗肿瘤活性筛选
评估TEN对HCC细胞活力、增殖和形态的影响
Hep3B和HCCLM3细胞以不同浓度TEN处理48 h，CCK8检测细胞活力，显微镜观察形态，克隆形成实验检测增殖能力。
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远志皂苷元通过SIRT5调节琥珀酰化抑制肝细胞癌细胞的致瘤性
Tenuigenin regulates succinylation via SIRT5 for suppressing the tumorigenicity of hepatocellular carcinoma cells.
实验完整度
高包含体外细胞实验（CCK8、流式、Western blot）、组学分析（RNA-seq、LC-MS）、 Seahorse代谢分析、体内裸鼠移植瘤模型及病理分析，并进行SIRT5敲低/过表达功能验证，证据层级丰富。
主要模型
Hep3B肝癌细胞系 HCCLM3肝癌细胞系 裸鼠Hep3B细胞皮下移植瘤模型
重点核对
TEN浓度10、20、50 μM处理48 h CDDP 2 μg/mL作为阳性对照 体内TEN给药剂量5、10、15、20 mg/kg，每日腹腔注射 SIRT5 siRNA序列和过表达载体转染验证 RNA-seq和LC-MS样本重复数n=3和n=6
摘要
远志皂苷元是从远志根中提取的活性成分，据报道具有抗失眠、抗遗忘、神经保护和抗炎作用。本研究旨在探讨TEN对肝细胞癌细胞系Hep3B和HCCLM3的抗肿瘤作用及其潜在分子机制，采用CCK8、qRT-PCR、流式细胞术、RNA测序和LC-MS进行体外实验，并通过肿瘤异种移植模型进行体内实验。结果表明，TEN在体内和体外均具有强抗肿瘤作用，通过抑制S期细胞周期进入和迁移，并促进Hep3B和HCCLM3细胞凋亡，显著抑制HCC细胞增殖。体内实验中，TEN通过降低Ki67和BCL2表达显著抑制肿瘤生长。机制探讨发现，通过抑制琥珀酸代谢物合成干扰中心碳代谢是这些变化的中介，提示TEN处理影响了癌细胞代谢途径。此外，TEN显著增加去琥珀酰化酶SIRT5的表达，导致整体琥珀酰化和特异性组蛋白H3赖氨酸122琥珀酰化（H3K122su）水平降低，同时调节HCC细胞中的ERK/JNK信号通路。结论：TEN通过靶向SIRT5-琥珀酰化在HCC细胞中发挥抗肿瘤作用，因此TEN是用于HCC靶向治疗的强力潜在候选抗肿瘤药物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TEN是否具有抗肝细胞癌作用，其分子机制是否涉及SIRT5介导的琥珀酰化及代谢重编程？
- 核心机制
- TEN通过上调去琥珀酰化酶SIRT5表达，降低琥珀酸水平及总体和H3K122位点琥珀酰化，同时抑制ERK/JNK信号通路，从而抑制HCC细胞增殖和迁移并促进凋亡。
- 主要证据
- 体外CCK8、克隆形成、流式细胞术、Transwell和TUNEL实验显示TEN抑制增殖和迁移并诱导凋亡；RNA-seq和LC-MS显示中心碳代谢及琥珀酸代谢改变；Western blot验证SIRT5表达及信号通路蛋白；体内移植瘤实验显示TEN抑制肿瘤生长且降低Ki67和BCL2表达。
- 研究意义
- 首次表明TEN-SIRT5轴通过调节琥珀酰化和ERK/JNK信号通路调控HCC细胞的致瘤行为，支持TEN作为HCC治疗候选药物的潜力，为靶向琥珀酰化的天然化合物研究提供依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
转录组分析
鉴定TEN处理后HCC细胞中差异表达基因及富集通路
HCCLM3细胞经TEN（20 μM）处理48 h后提取RNA进行RNA-seq，分析DEGs，并进行GO和KEGG富集分析。
细胞周期和凋亡检测
验证TEN对HCC细胞周期和凋亡的影响
流式细胞术检测细胞周期和凋亡，qRT-PCR和Western blot检测细胞周期和凋亡相关基因表达，TUNEL染色观察凋亡。
细胞迁移检测
评估TEN对HCC细胞迁移能力的影响
划痕实验和Transwell实验检测细胞迁移，qRT-PCR和Western blot检测迁移相关蛋白表达。
代谢组学及代谢通量分析
分析TEN对HCC细胞中心碳代谢及琥珀酸水平的影响
LC-MS检测代谢物变化，Seahorse分析氧化磷酸化，验证代谢通路变化。
琥珀酰化及信号通路蛋白检测
探究TEN对琥珀酰化修饰和ERK/JNK信号通路的影响
Western blot检测琥珀酰化水平（Ksu）、H3K122su和HO-1，以及p-ERK、p-p38、p-JNK蛋白表达，并使用抑制剂NAC和U0126验证通路。
SIRT5功能验证
验证SIRT5在TEN调控琥珀酰化和细胞功能中的关键作用
使用siRNA敲低SIRT5和过表达载体（oe-SIRT5），检测琥珀酰化水平、细胞迁移和增殖。
体内抗肿瘤实验
评估TEN在体内的抗肿瘤效果
将Hep3B细胞注射到裸鼠腋下建立移植瘤模型，腹腔注射不同浓度TEN或溶剂对照，测量肿瘤体积和重量，并进行组织学分析。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
细胞迁移检测
蛋白表达检测
统计分析与评价
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜氏改良Eagle培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | Gibco | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Gibco | -- | |
| 药物处理 | 远志皂苷元 | MedChemExpress | C30H45ClO6 |
| 二甲基亚砜 | -- | -- | |
| 细胞活力检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| 细胞周期检测 | RNase A | Sigma Aldrich | -- |
| 碘化丙啶 | BD | -- | |
| 凋亡检测 | FITC标记的Annexin V | NeoBioscience | -- |
| 结合缓冲液 | BD | -- | |
| 流式分析 | DxFLEX流式细胞仪 | Beckman | -- |
| ROS检测 | 活性氧检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blot | PVDF膜 | Millipore | -- |
| 抗CDK2、CDK4、cyclin D1、N-cadherin、E-cadherin、vimentin、caspase 8、MCL1、survivin、β-actin抗体 | ZENBIO | -- | |
| HRP标记的二抗 | -- | -- | |
| ECL化学发光检测系统 | ZENBIO | -- | |
| 迁移检测 | Transwell细胞板（8 μm） | Millipore | -- |
| 凋亡检测 | TUNEL试剂 | Mingbo | -- |
| EdU检测 | EdU检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | TIANGEN | -- |
| RNA-seq | 转录组测序 | BGI Co., Ltd. | -- |
| qRT-PCR | ABI 7500实时荧光定量PCR仪 | ABI | -- |
| LC-MS | 液相色谱-质谱分析 | BGI Co., Ltd. | -- |
| siRNA转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 体内实验 | 基质胶 | Corning | -- |
| 顺铂 | -- | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞活力检测 | 细胞系、种子密度、处理浓度、处理时间、CCK-8孵育时间、重复数 阅读提示：Materials and methods 'Cell viability assay' 及图1图注 |
| 细胞周期和凋亡 | 处理浓度和时间、染色剂及孵育时间、流式细胞仪型号 阅读提示：Materials and methods 'Flow cytometry' 及图3、图4图注 |
| 细胞迁移检测 | 划痕方法、Transwell孔径和细胞数、处理时间、染色方法 阅读提示：Materials and methods 'Cell migration assay' 及图5图注 |
| 代谢组学分析 | 样本量、处理浓度和时间、代谢物提取方法、差异代谢物筛选标准 阅读提示：Materials and methods 'Liquid chromatography–mass spectrometry (LC–MS) experimental methodology' 及图6图注 |
| 信号通路验证 | 抑制剂浓度（NAC、U0126）、处理时间、蛋白检测目标 阅读提示：Materials and methods 'Western blot analysis' 及图7图注 |
| 体内实验 | 动物品系、细胞注射数量、肿瘤模型建立、分组和给药方案、肿瘤测量和终点 阅读提示：Materials and methods 'In vivo anti-tumor study and histochemistry analysis' 及图9图注 |