整合单细胞转录组分析鉴定银屑病角质形成细胞中的关键基因
通过整合多个单细胞RNA-seq数据集，鉴定银屑病角质形成细胞中显著上调的基因。
整合了5个独立单细胞RNA-seq数据集（GSE151177, GSE162183, GSE173706, GSE230842, GSE248121），通过Seurat和Harmony进行数据整合，UMAP聚类和细胞类型注释，比较银屑病和正常组织中各角质形成细胞亚群的差异表达基因。
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过度激活的IL-17/NF-κB1轴介导的TYMP上调通过增强异常角化和中性粒细胞介导的炎症促进银屑病
TYMP upregulation mediated by the hyperactivated IL-17/NF-κB1 axis promotes psoriasis through enhancing aberrant keratinization and neutrophil-mediated inflammation.
实验完整度
高研究包含单细胞和批量RNA-seq的整合分析、体外细胞实验（M5刺激、TYMP过表达、NF-κB1过表达、双荧光素酶报告实验）、体内小鼠模型（IMQ诱导）及功能验证，证据层级多元。
主要模型
HaCaT细胞系（人角质形成细胞） IMQ诱导的银屑病样小鼠模型 临床皮肤样本（银屑病患者皮损和正常皮肤）
重点核对
M5细胞因子混合物（IL-1α、IL-17、IL-22、TNF-α、Oncostatin M各10 μg/L）处理HaCaT细胞72小时 TYMP过表达HaCaT细胞系的建立（慢病毒转染） NF-κB1过表达HaCaT细胞系及双荧光素酶报告基因检测 Tipiracil处理浓度：体外10 μM，体内1 mg/kg灌胃 IMQ诱导小鼠模型：每日局部涂抹，共7天
摘要
银屑病是一种常见的慢性复发性免疫介导性疾病，全球患病率高，亟需新型生物标志物以改善诊断和治疗。本研究通过整合单细胞和批量RNA测序分析，全面鉴定了银屑病组织中的差异表达基因（DEGs）。胸苷磷酸化酶（TYMP）成为银屑病中上调最显著的生物标志物之一。多重免疫组织化学（mIHC）和IHC实验共同证实TYMP在银屑病角质形成细胞中显著过表达。机制上，我们证明IL-17介导的炎症信号通过NF-κB1转录诱导TYMP表达。TYMP过表达促进角质形成细胞增殖，并激活银屑病中与角化和中性粒细胞脱颗粒相关的信号通路。免疫浸润分析、血常规检查和ELISA证实TYMP上调与银屑病中性粒细胞脱颗粒密切相关。在咪喹莫特（IMQ）诱导的银屑病样小鼠模型中，tipiracil对TYMP的药理学抑制部分逆转了TYMP过表达的病理效应，包括加速的角质形成细胞增殖、异常角化和中性粒细胞驱动的炎症。总之，TYMP在银屑病中因IL-17/NF-κB1信号过度激活而过表达。通过Tipiracil靶向TYMP通过抑制异常角化和中性粒细胞脱颗粒改善银屑病症状，从而突出其作为银屑病治疗靶点的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- TYMP在银屑病中过度表达的机制及其在银屑病发病中的功能作用是什么？
- 核心机制
- IL-17信号过度激活导致NF-κB1介导的TYMP转录上调，TYMP促进角质形成细胞增殖、异常角化和中性粒细胞脱颗粒，加剧银屑病炎症。
- 主要证据
- 通过单细胞和批量RNA-seq分析、IHC/mIHC、体外细胞实验（M5刺激、TYMP过表达、NF-κB1过表达、双荧光素酶报告）、体内IMQ小鼠模型，证明TYMP上调与角质形成细胞增殖、角化及中性粒细胞脱颗粒相关。
- 研究意义
- 本研究强调TYMP作为银屑病的潜在治疗靶点，药理学抑制TYMP（如TPI）可有效减轻疾病相关的病理进展。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
批量RNA测序验证TYMP上调
通过自身队列的批量RNA测序验证TYMP在银屑病中的上调。
对6个正常皮肤和8个银屑病皮损进行RNA-seq，使用DESeq2鉴定DEGs，并通过多个独立队列（GSE117405, GSE34248, GSE13355, GSE14905）和IHC验证TYMP表达。
体外验证炎症因子诱导TYMP表达
验证IL-17等炎症因子是否诱导角质形成细胞中TYMP表达。
用M5细胞因子混合物（含IL-17）处理HaCaT细胞72小时，通过RNA-seq、qRT-PCR和Western blot检测TYMP表达。同时分析公共数据集GSE171170和GSE31652。
验证NF-κB1转录激活TYMP
验证NF-κB1是否直接结合TYMP启动子并转录激活TYMP表达。
通过启动子分析、NF-κB1过表达HaCaT细胞系、qRT-PCR、Western blot和双荧光素酶报告实验验证。
功能研究：TYMP过表达对角质形成细胞增殖的影响
评估TYMP过表达对角质形成细胞增殖的影响。
建立TYMP过表达HaCaT细胞系，进行CCK-8、集落形成、EdU染色和细胞周期分析，并用TPI处理观察逆转效果。
转录组分析揭示TYMP过表达激活的信号通路
探索TYMP过表达对信号通路的影响。
对TYMP过表达和对照HaCaT细胞进行RNA-seq，进行DEG、GO/KEGG和GSEA分析，发现角化和中性粒细胞脱颗粒通路激活。
临床样本和患者血液分析
验证TYMP表达与中性粒细胞炎症的相关性。
通过mIHC、血常规和ELISA分析银屑病患者皮损和外周血中中性粒细胞相关指标及S100A8/A9等水平。
体内验证TPI的治疗效果
评估TYMP抑制剂TPI在IMQ诱导的银屑病小鼠模型中的疗效。
建立IMQ诱导的小鼠银屑病模型，给予TPI口服治疗，通过HE染色、IHC、ELISA和NETs标记检测评估效果。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
数据整合分析
验证细胞功能变化
验证机制链路
评估体内效果
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | -- | -- |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 青霉素/链霉素 | -- | -- | |
| 细胞因子处理 | M5细胞因子混合物 | Neobioscience Technology Co, Ltd | -- |
| RNA提取 | TRIzol试剂 | Invitrogen | -- |
| 逆转录 | PrimeScript™ RT试剂盒（Perfect Real Time） | Takara | -- |
| qPCR | One Step TB Green PrimeScript™ RT-PCR试剂盒II | Takara | -- |
| Bio-Rad CFX Manager 3.1实时荧光定量PCR系统 | Bio-Rad | -- | |
| ELISA | S100A7 ELISA试剂盒 | ABclonal | RMK0080 |
| S100A8 ELISA试剂盒 | Meikebio | MK3813A | |
| S100A9 ELISA试剂盒 | Meikebio | MK0612MB | |
| MPO ELISA试剂盒 | Meikebio | MK0651B | |
| 免疫组化 | 抗TYMP抗体 | Abclonal | A1094 |
| mIHC | 多重免疫荧光试剂盒 | Servicebio Technology | -- |
| 抗S100A8抗体 | Servicebio | GB11421 | |
| 抗SPRR1B抗体 | Abclonal | 11959-1-AP | |
| 抗KRT1抗体 | Servicebio | GB111277 | |
| 抗CitH3抗体 | Abcam | ab5103 | |
| 抗MPO抗体 | Servicebio | GB11224 | |
| Western blot | 抗NF-κB1抗体 | ABclonal | A11160 |
| 抗S100A7抗体 | ABclonal | A22271 | |
| 抗S100A8抗体 | ABclonal | A12018 | |
| 抗S100A9抗体 | ABclonal | A9842 | |
| 抗GAPDH抗体 | ABclonal | AC054 | |
| RIPA裂解液 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 辣根过氧化物酶标记的二抗 | Earthox | -- | |
| SuperLumia ECL HRP底物试剂盒 | Abbkine | -- | |
| Bio-Rad成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| 动物实验 | 咪喹莫特 | Sichuan Mingxin Pharmaceutical Co., Ltd. | -- |
| 替吡嘧啶盐酸盐 | -- | -- | |
| 凡士林 | Unilever | -- | |
| 图像采集 | 徕卡激光显微切割系统 | Leica | -- |
| 图像分析 | ImageScope图像分析软件 | 3DHISTECH | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 单细胞分析 | 数据集来源（GSE151177等）、细胞过滤参数（feature counts 200-8000,线粒体基因<20%）、批次效应校正方法（Harmony） 阅读提示：Materials and methods 中的 Single-cell analysis 部分 |
| M5刺激实验 | HaCaT细胞来源、培养条件、M5细胞因子浓度（各10 μg/L）、处理时间（72小时） 阅读提示：Materials and methods 中的 M5 pro-inflammation cytokines treatment 部分 |
| NF-κB1过表达实验 | 慢病毒转染方法、NF-κB1过表达验证、双荧光素酶报告实验构建 阅读提示：Materials and methods 中的相关部分及 Figure 5 |
| TYMP过表达实验 | 慢病毒转染方法、过表达效率验证、TPI处理浓度（10 μM） 阅读提示：Materials and methods 中的相关部分及 Figure 6 |
| IMQ小鼠模型 | 小鼠品系、年龄、性别、分组（n=5）、IMQ涂抹剂量和时长（每日一次，连续7天）、TPI给药剂量（1 mg/kg）、给药方式（口服灌胃） 阅读提示：Materials and methods 中的 IMQ mouse model and tipiracil treatment 部分 |