EV-A71感染诱导细胞死亡和焦亡形成
验证EV-A71感染是否在SH-SY5Y细胞中诱导细胞死亡，特别是焦亡
使用EV-A71感染SH-SY5Y细胞，通过Annexin V-FITC/PI染色、CCK-8、LDH释放、caspase-1活性检测、qRT-PCR和WB检测焦亡相关分子表达，以及ELISA检测IL-1β和IL-18分泌
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EV-A71感染的神经病理机制归因于通过激活hsa_circ_0045431/hsa_miR_584/NLRP3调控轴介导的炎症性焦亡和病毒复制
The neuropathological mechanism of EV-A71 infection attributes to inflammatory pryoptosis and viral replication via activating the hsa_circ_0045431/ hsa_miR_584/NLRP3 regulatory axis.
实验完整度
高包含体外细胞模型、circRNA测序、功能获得/丧失实验、双荧光素酶报告、IF、WB、qRT-PCR等多层级验证，并验证了分子机制和病毒复制。
主要模型
SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞 Vero细胞（用于病毒滴度测定） HEK293T细胞（用于双荧光素酶报告）
重点核对
EV-A71感染SH-SY5Y细胞，MOI=0.1 病毒感染后0、6、12、24、48、72小时的时间点 hsa_circ_0045431、hsa_miR_584和NLRP3的过表达和敲低 双荧光素酶报告基因检测hsa_circ_0045431与hsa_miR_584以及hsa_miR_584与NLRP3的结合 细胞活力、LDH释放、caspase-1活性、焦亡相关蛋白表达和细胞因子分泌的检测
摘要
神经病理损伤被认为是EV-A71感染死亡的主要原因，但其潜在机制尚未阐明。焦亡是一种新型的炎症性程序性细胞死亡，已被证实参与多种病毒的发病机制。circRNA是一种新型的内源性非编码RNA，近年来引起研究兴趣，尤其是在病毒感染过程中的特殊作用。因此，在本研究中，我们将EV-A71、焦亡和circRNA结合起来，寻找EV-A71感染发病机制的突破口。首先，通过一系列检测细胞死亡、细胞活力、LDH释放、caspase 1活性、焦亡相关分子的表达水平以及IL-1β和IL-18的浓度，检查EV-A71感染是否导致焦亡形成。其次，进行circRNA高通量测序，以挖掘可能与焦亡形成相关的circRNA-miRNA-mRNA调控轴。最后，进一步进行功能获得和功能丧失实验以确定其功能。我们的结果表明，EV-A71感染在SH-SY5Y细胞中引起焦亡形成。circRNA测序分析了差异表达的circRNA及其可能的功能。发现hsa_circ_0045431/hsa_miR_584/NLRP3调控轴可能参与EV-A71感染期间的焦亡形成。然后，通过IF、双荧光素酶、qRT-PCR和WB实验验证了hsa_circ_0045431海绵吸附hsa_miR_584以及hsa_miR_584直接靶向NLRP3。功能实验进一步揭示，hsa_circ_0045431和NLRP3的上调促进了炎症性焦亡和病毒复制，而hsa_miR_584的上调抑制了炎症性焦亡和病毒复制，反之亦然。总的来说，我们的研究揭示了EV-A71感染通过激活hsa_circ_0045431/hsa_miR_584/NLRP3调控轴诱导焦亡形成，进而影响病毒复制。这些发现为EV-A71感染的发病机制提供了新的见解，同时揭示了hsa_circ_0045431/hsa_miR_584/NLRP3调控轴可作为EV-A71感染的潜在生物治疗靶点。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- EV-A71感染如何通过circRNA-miRNA-mRNA调控轴诱导神经细胞焦亡并影响病毒复制？
- 核心机制
- EV-A71感染通过激活hsa_circ_0045431/hsa_miR_584/NLRP3调控轴，即hsa_circ_0045431海绵吸附hsa_miR_584，解除其对NLRP3的抑制，从而促进NLRP3介导的炎症性焦亡和病毒复制。
- 主要证据
- 在人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞中，EV-A71感染诱导焦亡标志物（NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD、IL-1β、IL-18）表达升高；circRNA测序和双荧光素酶报告实验验证了hsa_circ_0045431、hsa_miR_584和NLRP3的调控关系；功能实验显示调控轴可促进焦亡和病毒复制。
- 研究意义
- 研究为EV-A71感染的发病机制提供了新见解，并提示hsa_circ_0045431/hsa_miR_584/NLRP3调控轴可作为EV-A71感染的潜在治疗靶点。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
circRNA测序和生物信息学分析
寻找与焦亡相关的circRNA-miRNA-mRNA调控轴
对EV-A71感染的SH-SY5Y细胞进行circRNA高通量测序，鉴定差异表达circRNA，进行GO和KEGG富集分析，并构建circRNA-miRNA-mRNA共表达网络
验证hsa_circ_0045431、hsa_miR_584和NLRP3之间的调控关系
验证hsa_circ_0045431海绵吸附hsa_miR_584以及hsa_miR_584靶向NLRP3
使用FISH实验、双荧光素酶报告基因实验、qRT-PCR和WB验证结合关系
功能获得和丧失实验
评估hsa_circ_0045431/hsa_miR_584/NLRP3调控轴对焦亡、炎症反应和病毒复制的影响
在SH-SY5Y细胞中分别过表达或敲低hsa_circ_0045431、hsa_miR_584和NLRP3，然后感染EV-A71，检测细胞活力、LDH释放、caspase-1活性、焦亡相关蛋白表达、炎症因子分泌、病毒载量和病毒滴度
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| 胎牛血清 | HyClone | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | -- | |
| 转染 | Lipofectamine 3000转染试剂 | Thermo Fisher | -- |
| 免疫荧光 | DAPI | Beyotime | -- |
| qRT-PCR | Trizol试剂 | Tiangen | -- |
| RNase R | epicenter | -- | |
| Prime Script RT Master Mix | Takara | -- | |
| SYBR Green Master Mix | Takara | -- | |
| Step One Plus实时荧光定量PCR系统 | Applied Biosystems | -- | |
| 流式细胞术 | Annexin V-FITC/PI双染试剂盒 | YEASEN | -- |
| 细胞增殖检测 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | -- |
| LDH检测 | LDH细胞毒性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| Caspase-1活性检测 | Caspase-1活性检测试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blot | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | Roche Applied Science | -- | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | BioRad | -- | |
| PVDF膜 | Millipore | -- | |
| ECL化学发光试剂盒 | Beyotime | -- | |
| 抗NLRP3抗体 | Affinity | -- | |
| 抗ASC抗体 | Affinity | -- | |
| 抗Caspase-1抗体 | Affinity | -- | |
| 抗Gasdermin D抗体 | Affinity | -- | |
| 抗IL-1β抗体 | Affinity | -- | |
| 抗IL-18抗体 | Affinity | -- | |
| 抗VP1抗体 | -- | -- | |
| 抗GAPDH抗体 | CST | -- | |
| HRP标记的山羊抗兔二抗 | CST | -- | |
| HRP标记的山羊抗小鼠二抗 | CST | -- | |
| ELISA | IL-1β ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| IL-18 ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- | |
| 炎症因子检测 | Bio-Plex细胞因子检测试剂盒 | RAISECARE | -- |
| circRNA测序 | Ribo-Zero™磁珠试剂盒 | epicenter Technologies | -- |
| NEBNext Ultra RNA文库制备试剂盒（Illumina） | NEB | -- | |
| 双荧光素酶报告基因 | pGL3-Basic载体 | Promega | -- |
| Lipofectamine 2000转染试剂 | Invitrogen | -- | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | -- | |
| 免疫荧光 | 抗VP1抗体 | Millipore | -- |
| 抗裂解Caspase-1抗体 | Affinity | -- | |
| 抗NLRP3抗体 | Affinity | -- | |
| FITC标记的山羊抗小鼠IgG | CST | -- | |
| Daylight 594标记的山羊抗兔IgG | CST | -- | |
| 共聚焦荧光显微镜 | Leica | -- | |
| 流式细胞术 | 流式细胞仪 | Agilent | -- |
| 细胞增殖检测 | 酶标仪 | Tecan | -- |
| 病毒滴度测定 | Vero细胞 | -- | -- |
| 过表达/敲低载体构建 | hsa_circ_0045431、miR-584和NLRP3的过表达和敲低载体 | Genepharma | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养与病毒感染 | SH-SY5Y细胞培养条件（DMEM+10%FBS）、EV-A71感染MOI=0.1、感染时间点0-72小时 阅读提示：Materials and Methods 2.1 Cell culture, virus infection and transfection |
| 细胞死亡和焦亡检测 | Annexin V-FITC/PI染色、CCK-8、LDH释放、caspase-1活性、焦亡相关蛋白表达、IL-1β和IL-18 ELISA 阅读提示：Materials and Methods 2.5-2.10; Results 3.1-3.2 |
| circRNA测序 | RNase R处理、建库试剂盒、Illumina平台、差异表达circRNA筛选标准、GO/KEGG富集分析 阅读提示：Materials and Methods 2.12; Results 3.4 |
| 分子间调控验证 | 双荧光素酶报告基因检测hsa_circ_0045431与miR-584、miR-584与NLRP3的结合；FISH实验；qRT-PCR验证表达 阅读提示：Materials and Methods 2.13; Results 3.5-3.6 |
| 功能实验 | hsa_circ_0045431、miR-584和NLRP3的过表达/敲低效率；EV-A71感染后的细胞活力、LDH释放、caspase-1活性、焦亡蛋白表达、炎症因子分泌、病毒载量和滴度 阅读提示：Materials and Methods 2.1-2.6; Results 3.7-3.8 |