构建OMV腔内表达平台
比较三种腔内表达模式（OmpA-SP、Lpp-SP+C、OmpA(1-199aa)）的载量效率
通过Red/ET方法将mCherry融合基因整合到EcN基因组，分别构建OSm-OMVs、LSm-OMVs、OLm-OMVs，检测荧光强度。
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工程化益生菌来源的外膜囊泡作为功能性疫苗载体以增强针对SARS-CoV-2的免疫应答
Engineering probiotic-derived outer membrane vesicles as functional vaccine carriers to enhance immunity against SARS-CoV-2.
实验完整度
高包含分子构建、体外细胞实验（BMDC成熟）、动物免疫实验等多个独立证据层级，并进行了功能验证和机制验证。
主要模型
Escherichia coli Nissle 1917 (EcN)及其衍生菌株 DC2.4细胞系 小鼠骨髓来源树突状细胞（BMDC） BALB/c小鼠
重点核对
OMV制备：菌株在LB培养基中37°C培养18h，诱导时加入30mM阿拉伯糖，超速离心和过滤纯化 免疫剂量：小鼠腹腔注射10μg OMV（总蛋白），RBD+Alum组为2μg RBD混合Alum，共三次（第0、10、20天） BMDC成熟实验：BMDC与PBS、LPS (0.24mg/mL)、RBD (100ng/mL)、WT-OMVs (25μg/mL)或NR-OMVs (25μg/mL)共培养12h 表面展示验证：Proteinase K处理OMVs后检测荧光或ELISA，以确认抗原定位
摘要
由于SARS-CoV-2变异株的持续出现，如何高效展示多价抗原引起了人们的极大兴趣。细菌外膜囊泡（OMVs）因其自佐剂特性和可修饰抗原的能力，可作为一种有吸引力的疫苗递送系统。在此，我们基于工程化OMVs建立了一个双价抗原展示平台，使用mCherry和GFP，并证明了SARS-CoV-2的两种不同抗原可以同时呈现在OMVs的腔隙和表面。比较免疫原性时，ClyA-NG06融合蛋白和棘突蛋白的受体结合域（RBD）在OMV腔隙中诱导了比单独展示ClyA-NG06融合蛋白或RBD的OMVs更强的小鼠体液免疫应答。总之，我们提供了一种在同一个OMV的腔隙和表面展示SARS-CoV-2抗原的有效方法，并强调了OMVs作为通用多抗原载体的潜力。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 如何利用工程化细菌外膜囊泡（OMVs）同时展示SARS-CoV-2的多个抗原，并增强其免疫原性？
- 核心机制
- OMVs的周质表达系统（OmpA信号肽）有助于RBD的正确折叠，通过ClyA融合在表面展示NG06，协同增强抗体应答。
- 主要证据
- NR-OMVs（腔内RBD，表面NG06）免疫小鼠后，产生比单独NG06-OMVs或RBD-OMVs更强的抗RBD IgG抗体应答，且优于RBD+Alum组。
- 研究意义
- 为开发基于OMVs的多抗原疫苗载体提供了一种有效策略，具有作为通用多抗原载体的潜力。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
构建双抗原展示OMV（mG-OMV）
验证OMV表面和腔内能否同时展示两种不同抗原
通过质粒pBAD24表达ClyA-GFP融合蛋白，与腔内表达mCherry的EcN-NM菌株组合，纯化后通过Western blot和荧光分析确认。
构建NR-OMV疫苗候选物
将SARS-CoV-2 RBD（腔内）和NG06（表面）共展示在OMV上
通过周质表达将RBD装载到OMV腔内，利用ClyA-NG06融合展示在表面，通过Western blot和ELISA验证。
体外BMDC成熟实验
评估NR-OMVs是否能被树突状细胞摄取并促进其成熟
用DiD标记的OMV与DC2.4共培养，流式检测摄取；将BMDC与PBS、LPS、RBD、WT-OMVs、NR-OMVs共培养，检测CD86、MHC-II表达和细胞因子分泌。
小鼠免疫实验
评估NR-OMVs诱导的体液免疫应答
BALB/c小鼠腹腔注射不同疫苗，第0、10、20天免疫，第10、30天采血，ELISA检测抗RBD IgG滴度。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 抗体 | SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD抗体 | SinoBiological | 40592-T62 |
| GFP标签单克隆抗体 | Proteintech | 66002-1-Ig | |
| mCherry多克隆抗体 | Proteintech | 26765-1-AP | |
| 山羊抗兔IgG-HRP | Proteintech | SA00001-2 | |
| 流式分析 | PE抗小鼠CD11c | TONBO | 50-0114-U100 |
| APC-CD86单克隆抗体 | eBioscience | 17-0862-81 | |
| FITC-MHC II类单克隆抗体 | eBioscience | 11-5321-81 | |
| 菌株 | 大肠杆菌DH5α | Biobw | Bio82081 |
| 大肠杆菌MG1655 | Biobw | Bio82268 | |
| 大肠杆菌Nissle 1917 | Biobw | Bio089890 | |
| 重组蛋白 | 重组SARS-CoV-2 Spike RBD蛋白 | Sangon Biotech | C500304-0001 |
| 细胞标记 | DiD细胞标记液 | Thermo Fisher | V22887 |
| 限制性内切酶 | FastDigest HindIII | Thermo Fisher | FD0505 |
| FastDigest NcoI | Thermo Fisher | FD0574 | |
| 染色 | 四水合钼酸铵 | Solarbio | A7120 |
| PCR | Phanta Max超保真DNA聚合酶 | Vazyme | P505-d1 |
| 蛋白处理 | 蛋白酶K | TransGen | GE201-01 |
| 缓冲液 | 10×PBS缓冲液 | Solarbio | P1002 |
| 分子量标准 | 蛋白质分子量标准 | Thermo Fisher | 26617 |
| 封闭剂 | 牛血清白蛋白 | Solarbio | A8010 |
| 细胞刺激 | 脂多糖 | Solarbio | L8880 |
| 细胞培养 | 胎牛血清 | BIOIND | 04-001-1A |
| RPMI 1640培养基 | Gibco | 11875176 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Gibco | 25200072 | |
| 青霉素-链霉素溶液 | Solarbio | P1400 | |
| 细胞因子 | 粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | PeproTech | 96-315-03–5 |
| 白细胞介素-4 | PeproTech | 96-214-14–5 | |
| 红细胞裂解 | 红细胞裂解液 | Beyotime | C3702 |
| 电泳缓冲液 | 50×TAE缓冲液 | Sangon Biotech | B548101-0500 |
| 诱导剂 | L-(+)-阿拉伯糖 | Sangon Biotech | A610071-0025 |
| Western blot底物 | LumiQ HRP底物溶液 | ShareBio | SB-WB012 |
| 质粒提取 | 质粒提取试剂盒 | TIANGEN | DP103 |
| 胶回收 | 凝胶回收试剂盒 | TIANGEN | DP219 |
| 克隆 | Hieff Clone® Plus多片段一步克隆试剂盒 | YEASEN | 10912ES10 |
| OMV提取 | 细菌膜囊泡分离试剂盒 | RENGEN | BacMv40-10 |
| 细胞因子检测 | 小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | QuantiCyto | EMC102a |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | QuantiCyto | ECM004.96 | |
| 抗体滴度检测 | SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike RBD抗体滴度检测试剂盒 | SinoBiological | KIT006 |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒（CCK-8） | YEASEN | 40203ES60 |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0012 |
| 细胞系 | BMDC，BALB/c血浆 | Ziyuan Laboratory Animal Science and Technology Co. Ltd. | -- |
| DC2.4细胞 | KeyGEN Biotech | KG581 | |
| 实验动物 | BALB/c小鼠 | Ziyuan Laboratory Animal Science and Technology Co. Ltd. | -- |
| 质粒 | 质粒pBAD-ClyA-GFP | -- | -- |
| 质粒pBAD-ClyA-NG06 | -- | -- | |
| 质粒pBAD-ClyA-RBD | -- | -- | |
| 质粒pBAD24 | Miaolingbio | P0082 | |
| 质粒pKD46 | Miaolingbio | P0098 | |
| 质粒pKD3 | Miaolingbio | P0095 | |
| 质粒pET28a(+)-GFP | Miaolingbio | P0024 | |
| 质粒pET28a(+)-mCherry | -- | -- | |
| 质粒pSET152 | -- | -- | |
| 仪器 | ZetaView PMX110纳米颗粒跟踪分析仪 | Particle Metrix | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 菌株构建 | 菌株EcN、EcNΔnlpI、EcN-LSm等构建方法，使用Red/ET重组和pKD46质粒，需验证敲除或插入的正确性 阅读提示：STAR★Methods - Construction of plasmids and deletion mutants |
| OMV制备 | 培养条件（LB培养基，37°C，18h）、诱导剂浓度（30mM阿拉伯糖）、纯化方法（0.22μm过滤、100kDa超滤、OMV分离试剂盒） 阅读提示：STAR★Methods - Preparation of OMVs |
| 抗原定位验证 | Western blot检测ClyA-GFP、OmpA-mCherry、RBD、NG06；Proteinase K处理验证表面与腔内定位 阅读提示：STAR★Methods - Western blot analysis, Proteinase K treatment assay |
| BMDC成熟实验 | BMDC获取方法、刺激物浓度（LPS 0.24mg/mL, RBD 100ng/mL, OMV 25μg/mL）、共培养时间12h、流式抗体（CD11c, CD86, MHC-II）、细胞因子检测（IL-6, TNF-α） 阅读提示：STAR★Methods - Acquisition and maturation of BMDCs |
| 小鼠免疫实验 | BALB/c小鼠品系、周龄、性别（8周龄雌性）、免疫剂量（10μg OMV，RBD+Alum为2μg RBD+Alum）、免疫途径（腹腔注射）、免疫时间（0,10,20天）、采血时间（10,30天）、每组动物数量（n=6） 阅读提示：STAR★Methods - Mouse immunization |