Mesenchymal Stromal Cells Directly Promote Inflammation by Canonical NLRP3 and Non-canonical Caspase-11 Inflammasomes.
体外细胞实验、基因敲除小鼠实验、细菌感染和IBD动物模型以及患者样本分析，多层验证了NLRP3和caspase-11炎症小体的功能及66PR的抑制作用。
小鼠骨相关间充质基质细胞（BA-MSCs） NLRP3基因敲除小鼠来源的BA-MSCs caspase-11基因敲除小鼠来源的BA-MSCs DSS诱导的炎症性肠病小鼠模型
LPS（500 ng/ml）处理4小时，尼日利亚霉素（5 μM）处理1.5小时 NLRP3基因敲除、caspase-11基因敲除及caspase-1/11双敲除小鼠 66PR浓度为20 μM，体内给药剂量为5 mg/kg体重，每日一次 BA-MSCs移植剂量为2 × 10^6细胞/只小鼠
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
确定LPS和尼日利亚霉素刺激是否激活BA-MSCs中的NLRP3炎症小体，并评估其对IL-1β/18释放和焦亡的影响。
野生型和NLRP3基因敲除BA-MSCs用LPS（500 ng/ml）预处理4小时，然后用尼日利亚霉素（5 μM）刺激1.5小时；通过扫描电镜观察膜孔，免疫荧光检测GSDMDC1 foci，Western blot检测NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白，ELISA检测IL-1β/18水平。
确定caspase-11炎症小体是否在BA-MSCs中被激活并介导焦亡。
使用野生型、caspase-11基因敲除和caspase-1/11双敲除BA-MSCs，经LPS和尼日利亚霉素刺激后，检测膜孔、GSDMDC1 foci、caspase-11蛋白及IL-1β/18释放。
检查细菌感染是否激活BA-MSCs中的炎症小体。
通过尾静脉注射铜绿假单胞菌或大肠杆菌建立感染模型，从骨髓中分离BA-MSCs，通过Western blot检测NLRP3、caspase-1、caspase-11、IL-1β蛋白，并通过免疫荧光检测骨切片中GSDMDC1和CD51共定位。
确定在组织损伤炎症中BA-MSCs的炎症小体激活情况。
通过口服3% DSS诱导IBD小鼠模型，分离BA-MSCs，检测NLRP3、caspase-1、caspase-11蛋白水平，并检查骨切片中GSDMDC1/CD51 foci。
评估NLRP3基因缺陷的BA-MSCs对IBD小鼠的治疗效果及其存活情况。
将NLRP3基因敲除或野生型BA-MSCs移植到IBD小鼠中，记录临床评分、结肠长度、组织学评分，并使用CFSE追踪细胞存活。
确定化合物66PR是否能抑制BA-MSCs中NLRP3和caspase-11炎症小体的激活。
BA-MSCs用66PR（20 μM）和LPS预处理4小时，然后用尼日利亚霉素刺激1.5小时，检测膜孔、GSDMDC1 foci、IL-1β释放，并通过Western blot检测NLRP3、caspase-1、caspase-11蛋白表达。
验证66PR在体内是否抑制NLRP3炎症小体并改善IBD症状。
IBD小鼠腹腔注射66PR（5 mg/kg）或PBS，每天一次，检测体重、临床评分、结肠长度、组织学评分，并分析BA-MSCs中caspase-1和GSDMDC1的表达。
确定66PR预处理是否能提高BA-MSCs在IBD小鼠中的存活和治疗效果。
将66PR预处理的或未处理的GFP+BA-MSCs移植到IBD小鼠中，检测临床评分、结肠长度、组织学评分，并通过荧光和FACS分析GFP+细胞数量。
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM） | -- | -- |
| 胎牛血清（FBS） | -- | -- | |
| 青霉素-链霉素 | -- | -- | |
| 细胞刺激 | 脂多糖（LPS） | Sigma-Aldrich | -- |
| 尼日利亚霉素 | -- | -- | |
| 米奇利奥德 | -- | -- | |
| Western blot | RIPA裂解缓冲液 | -- | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | -- | -- | |
| PVDF膜 | -- | -- | |
| 抗NLRP3抗体 | Adipogen | AG-20B-0014 | |
| 抗caspase-1 p20抗体 | Adipogen | AG-20B-0042 | |
| 抗caspase-11抗体 | Adipogen | AG-20B-0061 | |
| 抗IL-1β抗体 | Cell Signaling Technology | 12426 | |
| 抗α-微管蛋白抗体 | Proteintech | 66031-1-Ig | |
| ELISA | 小鼠IL-1β ELISA试剂盒 | R&D Systems | -- |
| 小鼠IL-18 ELISA试剂盒 | Abcam | -- | |
| 小鼠IL-6 ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- | |
| 流式细胞术 | FITC抗小鼠CD45抗体 | BioLegend | 30-F11 |
| APC抗小鼠Ter119抗体 | eBioscience | 17-5921 | |
| PE抗小鼠CD44抗体 | BD Biosciences | IM7 | |
| PE抗小鼠CD51抗体 | eBioscience | RMV-7 | |
| APC抗小鼠CD90抗体 | BD Biosciences | OX-7 | |
| APC抗小鼠CD105抗体 | BioLegend | MJ7/18 | |
| PE抗小鼠CD146抗体 | eBioscience | P1H12 | |
| PE抗小鼠CD166抗体 | R&D Systems | 105902 | |
| FITC抗小鼠Sca-1抗体 | BioLegend | 122505 | |
| APC抗小鼠CD3抗体 | BioLegend | 17A2 | |
| FITC抗小鼠CD11c抗体 | BioLegend | 117306 | |
| APC抗小鼠CD11b抗体 | BioLegend | 101212 | |
| APC抗小鼠Gr1抗体 | eBioscience | 17-5931 | |
| FITC抗小鼠F4/80抗体 | BioLegend | 123108 | |
| APC抗小鼠CD19抗体 | eBioscience | 17-5921 | |
| FITC抗小鼠CD14抗体 | BioLegend | Sa14-2 | |
| 免疫荧光 | 抗GSDMD C1抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-393656 |
| FITC山羊抗小鼠IgG抗体 | Gene Copoeia | L146A | |
| Alexa Fluor 647山羊抗小鼠IgG抗体 | Gene Copoeia | L125A | |
| 细胞追踪 | CFSE细胞分裂追踪试剂盒 | BioLegend | B214561 |
| 动物实验 | 葡聚糖硫酸钠（DSS） | Sigma-Aldrich | -- |
| 66PR | -- | -- | |
| C57BL/6小鼠 | -- | -- | |
| 铜绿假单胞菌（P.a，ATCC 35218） | ATCC | -- | |
| 大肠杆菌（E. coli，ATCC 27853） | ATCC | -- | |
| 实验设备 | 扫描电子显微镜（Olympus N300M） | Olympus | -- |
| 共聚焦显微镜（Olympus IX81） | Olympus | -- | |
| 流式细胞仪（FACS） | -- | -- | |
| 分析软件 | Image J | -- | -- |
| 统计软件 | SPSS 16.0 | -- | -- |
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| BA-MSCs分离与培养 | 小鼠品系、年龄、组织来源（骨相关）、分离方法（酶消化法）、培养条件（培养基、血清浓度、温度、CO2浓度）、传代次数（2-3代）、细胞纯度（>90% CD45-/Ter119-） 阅读提示：Methods 2.3节 |
| 体外炎症小体激活 | LPS浓度（500 ng/ml）和刺激时间（4小时）、尼日利亚霉素浓度（5 μM）和刺激时间（1.5小时）、是否需要预刺激、对照组设置 阅读提示：图1和图2的图例 |
| 体内IBD模型 | DSS浓度（3%）和给药时间（7天）、小鼠品系（C57BL/6）、诱导方式（口服）、对照组设置 阅读提示：Methods 2.8节；图4和图6的图例 |
| 66PR处理 | 66PR浓度（体外20 μM，体内5 mg/kg体重每日一次）、给药途径（体内腹腔注射）、处理时间、溶剂对照（PBS） 阅读提示：Methods 2.8节；图5和图6图例 |
| BA-MSCs移植 | 移植细胞数量（2×10^6/只）、移植途径（腹腔注射）、细胞标记（CFSE或GFP）、移植时间（DSS诱导后第几天）、对照组设置（PBS） 阅读提示：Methods 2.8节；图4和图7图例 |
