临床样本相关性分析
验证B7-H3在CRC组织中的表达及其与血管生成指标CD31的关系
对125对CRC组织和癌旁正常组织进行IHC染色，检测B7-H3、CD31和VEGFA的表达，并分析相关性。
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B7-H3通过激活NF-κB通路诱导VEGFA表达促进结直肠癌血管生成
B7-H3 promotes colorectal cancer angiogenesis through activating the NF-κB pathway to induce VEGFA expression.
实验完整度
高包含临床样本IHC分析、体外HUVEC功能实验、体内Matrigel plug模型及机制验证，证据层级丰富。
主要模型
HCT116和RKO细胞系 HUVECs BALB/c裸鼠Matrigel plug移植瘤模型 125例CRC患者组织样本
重点核对
B7-H3敲低和过表达的CRC细胞系构建 HUVEC迁移、侵袭和管形成实验条件 VEGFA siRNA和中和抗体处理 BAY11-7082和bevacizumab体内给药剂量 B7-H3抗体3E8与BAY11-7082或bevacizumab联合处理
摘要
肿瘤血管生成是癌症的标志，并参与实体瘤的肿瘤发生。B7-H3作为一种免疫检查点分子，在多种肿瘤的增殖、转移和肿瘤发生中发挥关键作用；然而，关于B7-H3在调节结直肠癌（CRC）血管生成中的生物学功能和分子机制知之甚少。在本研究中，我们首先证明，在CRC患者组织样本中，B7-H3的表达显著上调，并与血小板-内皮细胞黏附分子-1（CD31）水平呈正相关。此外，一系列体外和体内实验表明，来自B7-H3敲低CRC细胞的条件培养基显著抑制人脐静脉内皮细胞（HUVECs）的迁移、侵袭和管形成，而B7-H3过表达则产生相反的效果。此外，B7-H3通过上调VEGFA表达促进肿瘤血管生成。重组VEGFA消除了shB7-H3 CRC细胞条件培养基对HUVEC血管生成的抑制作用，而VEGFA siRNA或VEGFA中和抗体逆转了B7-H3过表达CRC细胞条件培养基对HUVEC血管生成的作用。此外，我们验证了B7-H3通过激活NF-κB通路上调VEGFA表达和血管生成。总的来说，我们的发现确定了B7-H3/NF-κB/VEGFA轴在促进CRC血管生成中的作用，这为CRC治疗提供了一种有前景的方法。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- B7-H3在结直肠癌血管生成中的生物学功能和分子机制是什么？
- 核心机制
- B7-H3通过激活NF-κB通路上调VEGFA表达，从而促进CRC血管生成。
- 主要证据
- 在CRC细胞中敲低B7-H3抑制HUVEC迁移、侵袭和管形成，过表达则促进；VEGFA siRNA或中和抗体逆转此效应；体内实验中B7-H3敲低降低MVD和VEGFA表达，过表达则相反。
- 研究意义
- B7-H3/NF-κB/VEGFA轴可能是CRC治疗的有前景靶点，联合B7-H3抑制剂与BAY11-7082或贝伐珠单抗可能是一种有效的治疗策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体外细胞功能实验
检测B7-H3对HUVEC血管生成能力的影响
使用B7-H3敲低或过表达的HCT116和RKO细胞的条件培养基处理HUVEC，进行迁移、侵袭和管形成实验。
VEGFA介导的血管生成验证
验证B7-H3促进血管生成是否依赖VEGFA
使用重组VEGFA、VEGFA siRNA和VEGFA中和抗体处理条件培养基，观察对HUVEC血管生成能力的影响。
信号通路机制探究
确定B7-H3调控VEGFA表达所依赖的信号通路
检测B7-H3敲低后AKT、NF-κB、STAT3等信号通路磷酸化水平，并使用抑制剂验证NF-κB通路的作用。
体内动物模型验证
验证B7-H3在体内对CRC血管生成的作用及机制
将B7-H3敲低或过表达的HCT116细胞注入裸鼠皮下形成Matrigel plug，检测MVD和VEGFA表达，并用BAY11-7082或贝伐珠单抗处理。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证机制链路
评估体内效果
数据分析与统计
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Biological Industries | -- |
| 胎牛血清 | Biological Industries | -- | |
| 青霉素-链霉素 | Beyotime | C0222 | |
| EBM-2培养基 | Lonza | CC-3162 | |
| 细胞转染和感染 | Lipofectamine 2000转染试剂 | -- | -- |
| 免疫组织化学 | 山羊抗人4IgB7-H3抗体 | R&D Systems | AF1027 |
| 小鼠抗人CD31抗体 | Abcam | ab32457 | |
| 兔抗人VEGFA抗体 | Proteintech | 19003-1-AP | |
| 蛋白质印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | P0013D |
| 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 | Beyotime | P1045 | |
| 增强型BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | P0010 | |
| SDS-PAGE凝胶 | Beyotime | P0012AC | |
| PVDF膜 | GE Healthcare Life science | -- | |
| 牛血清白蛋白 | Fcmacs | FMS-WB021 | |
| HRP标记的二抗 | Beyotime | -- | |
| ECL化学发光试剂 | NCM Biotech | 10100 | |
| Chemi Doc MP成像系统 | Bio-Rad | -- | |
| RNA提取和实时PCR | TransZol Up Plus RNA试剂盒 | Transgen Biotech | ER501-01 |
| PrimeScript RT预混液 | Takara | RR036A | |
| SYBR Green预混液 | Vazyme | Q121-02-AA | |
| ELISA | 可溶性B7-H3 ELISA试剂盒 | Bright Scistar Biotechnology | XG-K3004 |
| VEGFA ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC108 | |
| bFGF ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC130 | |
| PDGF-BB ELISA试剂盒 | NeoBioscience | EHC181 | |
| 重组人B7-H3蛋白 | Sino Biological | 11188-H02H | |
| 细胞迁移和侵袭实验 | 8μm孔径Transwell小室 | BD Biosciences | 353097 |
| 人/灵长类VEGF抗体 | R&D Systems | MAB293 | |
| 重组人VEGF165蛋白 | Peprotech | 100-20 | |
| Matrigel基质胶 | Corning | 356234 | |
| 结晶紫 | Beyotime | C0121 | |
| 内皮管形成实验 | Matrigel基质胶 | Corning | -- |
| CCK8实验 | CCK-8试剂盒 | Dojindo | CK04 |
| 免疫荧光 | VEGFA抗体 | -- | -- |
| TRITC标记的山羊抗兔二抗 | KPL | -- | |
| DAPI染色液 | -- | -- | |
| 共聚焦激光扫描显微镜（Olympus FLUOVIEW FV1000） | Olympus | FV1000 | |
| 荧光素酶报告基因实验 | NF-κB荧光素酶报告质粒 | Genomeditech | GM-021001P100 |
| Promega被动裂解缓冲液 | Promega | E1910 | |
| 双荧光素酶报告基因检测系统 | Promega | E1910 | |
| 体内实验 | BAY11-7082 (NF-κB抑制剂) | MedChemExpress | HY-13453 |
| 贝伐珠单抗 | MedChemExpress | HY-P9906 | |
| B7-H3阻断抗体3E8 | Bright Scistar Biotechnology | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 临床样本分析 | B7-H3、CD31、VEGFA的IHC染色评分标准；患者样本的临床分期和淋巴结转移状态 阅读提示：Methods: CRC clinical samples and IHC assay; Results: Increased B7-H3 expression...; Figure 1 and Figure 3 |
| 细胞培养和转染 | HCT116和RKO细胞培养基成分；Lentivirus感染MOI (20)；siRNA转染试剂和浓度 阅读提示：Methods: Cell culture; Cell transfection and infection |
| 体外功能实验 | HUVEC迁移和侵袭实验的细胞数、孵育时间；管形成实验的细胞数和培养时间；条件培养基制备方法 阅读提示：Methods: Cell migration and invasion assay; Endothelial tube formation assay; Conditioned medium |
| 信号通路抑制实验 | BAY11-7082、perifosine、cryptotanshinone的处理浓度和时间；NF-κB活性检测方法 阅读提示：Methods: Luciferase reporter assay; Results: B7-H3 promotes VEGFA expression...; Figure 5 |
| 体内Matrigel plug实验 | 小鼠品系和性别；细胞注射数量；B7-H3敲低或过表达HCT116细胞；BAY11-7082和bevacizumab的给药剂量和频率；实验持续时间 阅读提示：Methods: Matrigel plug assay in vivo; Results: B7-H3 promotes angiogenesis in Matrigel plugs in vivo; Figure 6 |