体外验证福替尼对PD-L1表达的影响
考察不同浓度福替尼处理后结肠癌细胞中PD-L1及JAK2-STAT1通路蛋白的表达变化
用0、1、2、4 μM福替尼处理MC38、CT26、HCT116、HT29、SW480细胞24小时，Western blot检测PD-L1、JAK2、STAT1、p-STAT1等蛋白水平。
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福替尼与抗PD-1抗体联合免疫疗法治疗结直肠癌
Combination Foretinib and Anti-PD-1 Antibody Immunotherapy for Colorectal Carcinoma.
实验完整度
高包含体外细胞系实验、两种小鼠皮下移植瘤模型、肺转移模型、CD8+ T细胞清除实验，并通过流式、Western blot、qPCR、IHC等多层级验证功能和机制。
主要模型
MC38小鼠结肠癌皮下移植瘤模型 CT26小鼠结肠癌皮下移植瘤模型 CT26-Luc小鼠结肠癌肺转移模型 MC38、CT26、HCT116、HT29、SW480结肠癌细胞系
重点核对
福替尼处理浓度：0, 1, 2, 4 μM，处理24小时 MC38细胞接种量：1×10^6，CT26细胞：5×10^5，CT26-Luc细胞：2×10^5 福替尼给药剂量：5 mg/kg或10 mg/kg，每日口服灌胃 αPD-1抗体给药：腹腔注射，每3天一次，共4次 CD8+ T细胞清除：αCD8抗体（YTS169.4克隆），250 μg/只
摘要
免疫检查点抑制剂在癌症免疫治疗中取得了前所未有的成功。然而，对于许多癌症，免疫检查点抑制剂治疗的总缓解率仅为20%至40%，对于结直肠癌（CRC）患者甚至更低。因此，迫切需要开发针对CRC的有效免疫治疗策略。在这里，我们开发了一种新型的CRC联合疗法，由多受体酪氨酸激酶抑制剂（福替尼）和抗PD-1抗体组成。该联合疗法在小鼠中显著抑制了肿瘤生长，实现了改善的肿瘤消退且无复发（CT26肿瘤为83%，MC38肿瘤为50%），并延长了总生存期。机制上，福替尼通过激活JAK2-STAT1通路导致PD-L1水平升高，这可以提高免疫检查点抑制剂的疗效。此外，联合疗法通过进一步增加T细胞的浸润和改善其功能、降低肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的百分比并抑制其向M2表型极化，重塑了肿瘤微环境并增强了抗肿瘤免疫。此外，联合疗法通过减少BALB/c小鼠肺中调节性T细胞、TAMs和M2表型TAMs的比例，抑制了CT26-Luc肿瘤向肺的转移。这项研究表明，利用福替尼和抗PD-1抗体联合的新型联合疗法可能是CRC免疫治疗的有效联合策略。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 福替尼与抗PD-1抗体联合能否增强结直肠癌免疫治疗的效果，其机制是什么？
- 核心机制
- 福替尼通过激活JAK2-STAT1通路上调PD-L1表达，联合抗PD-1抗体后重塑肿瘤微环境：增加T细胞浸润和功能，降低TAMs比例并抑制其M2极化，从而增强抗肿瘤免疫。
- 主要证据
- 在MC38和CT26皮下瘤模型中，联合治疗显著抑制肿瘤生长（MC38抑制率98.05%，CT26完全消退率83%），并延长生存期；CD8+ T细胞清除完全消除抗肿瘤效果，表明依赖CD8+ T细胞；流式和IHC显示T细胞浸润增加、TAMs减少。
- 研究意义
- 该研究为福替尼与抗PD-1抗体联合治疗结直肠癌的临床转化提供了理论依据。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内验证福替尼对肿瘤生长和免疫细胞的影响
评估福替尼单药对MC38荷瘤小鼠肿瘤生长及肿瘤微环境中T细胞、CD11b+细胞和PD-L1表达的影响
MC38细胞皮下接种C57BL/6小鼠，肿瘤体积约100 mm3时分组，福替尼5 mg/kg每日灌胃，测量肿瘤体积，流式检测T细胞、CD11b+细胞比例及PD-L1表达，Western blot检测信号通路蛋白。
联合治疗在MC38模型中的抗肿瘤效果评估
比较福替尼、αPD-1单药及联合治疗对MC38肿瘤生长和生存期的影响
MC38皮下瘤模型，分组给予福替尼（5或10 mg/kg）、αPD-1抗体或联合治疗，测量肿瘤体积，记录生存期，评估肿瘤消退率。
联合治疗对T细胞浸润和功能的影响
检测联合治疗后肿瘤内T细胞浸润、功能及CD8+ T细胞依赖性
通过IHC和流式检测CD3+、CD4+、CD8+ T细胞浸润，流式检测IFN-γ+ T细胞和PD-1+ T细胞比例，并利用CD8+ T细胞清除实验验证其必要性。
联合治疗对TAMs和血管生成的影响
评估联合治疗对肿瘤内TAMs数量、M2极化及血管生成的影响
流式检测CD11b+F4/80+ TAMs比例及CD206表达，免疫荧光检测CD31+血管密度。
在CT26模型中的联合治疗效果验证
在另一结肠癌模型中验证联合治疗的抗肿瘤效果和免疫调节作用
CT26皮下瘤模型，给予联合治疗，测量肿瘤体积和生存期，流式检测T细胞、Tregs、TAMs，qPCR检测T细胞功能基因和TAM相关基因。
联合治疗对肺转移的影响
评估联合治疗对CT26-Luc细胞肺转移的抑制作用及肺部免疫微环境
CT26-Luc细胞尾静脉注射建立肺转移模型，生物发光成像监测转移，流式检测肺中T细胞、Tregs、TAMs。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
评估体内治疗效果
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 药物处理 | 福替尼 | Lollane Biological Technology | -- |
| 药物治疗 | 抗小鼠PD-1抗体（CD279）（克隆RMP1-14） | BioXCell | -- |
| 细胞培养 | 二甲基亚砜 | Solarbio Science and Technology | -- |
| 细胞裂解 | 红细胞裂解液（ACK裂解液） | Beyotime | -- |
| 免疫荧光 | 抗CD3单克隆抗体（11014） | Servicebio | 11014 |
| 抗CD8单克隆抗体（11068） | Servicebio | 11068 | |
| 抗CD31单克隆抗体（11063-2） | Servicebio | 11063-2 | |
| 流式细胞术 | 抗CD16/32单克隆抗体（553142） | BD Biosciences | 553142 |
| 抗CD45单克隆抗体（553079） | BD Biosciences | 553079 | |
| 抗CD3单克隆抗体（557596） | BD Biosciences | 557596 | |
| 抗CD8单克隆抗体（553079） | BD Biosciences | 553079 | |
| 抗CD4单克隆抗体（560782） | BD Biosciences | 560782 | |
| 抗IFN-γ单克隆抗体（554412） | BD Biosciences | 554412 | |
| 抗CD25单克隆抗体（557192） | BD Biosciences | 557192 | |
| 抗Foxp3单克隆抗体（563101） | BD Biosciences | 563101 | |
| 抗Ly-6G/Ly-6C (Gr-1)单克隆抗体（553128） | BD Biosciences | 553128 | |
| 抗CD11b单克隆抗体（557657） | BD Biosciences | 557657 | |
| 白细胞激活混合物（含BD GolgiPlug）（550583） | BD Biosciences | 550583 | |
| 抗CD4单克隆抗体（100559） | BioLegend | 100559 | |
| 抗PD-1单克隆抗体（135220） | BioLegend | 135220 | |
| 抗PD-L1单克隆抗体（124331） | BioLegend | 124331 | |
| 抗F4/80单克隆抗体（123110） | BioLegend | 123110 | |
| 抗MHC II类单克隆抗体（107625） | BioLegend | 107625 | |
| 抗CD206单克隆抗体（17-2061-82） | eBioscience | 17-2061-82 | |
| 转录因子缓冲液套装（562725） | BD Biosciences | 562725 | |
| 脾脏单核细胞提取 | Histopaque-1083 | Sigma-Aldrich | -- |
| 流式细胞术 | 固定缓冲液（420801） | BioLegend | 420801 |
| 胞内染色透化洗涤缓冲液（10x）（421001） | BioLegend | 421001 | |
| 免疫印迹 | 抗VEGFR2抗体（2479S） | Cell Signaling Technology | 2479S |
| 抗phospho-STAT1 (Y701)抗体（9167） | Cell Signaling Technology | 9167 | |
| 抗phospho-JAK2抗体（ET1607-34） | HUABIO | ET1607-34 | |
| 抗JAK2抗体（ET1607-35） | HUABIO | ET1607-35 | |
| 抗PD-L1抗体（ET1701-41） | HUABIO | ET1701-41 | |
| 抗STAT1抗体（ET1606-39） | HUABIO | ET1606-39 | |
| 抗phospho-STAT1 (S727)抗体（ET1611-20） | HUABIO | ET1611-20 | |
| 抗β-actin单克隆抗体（TA-09） | ZSGB-BIO | TA-09 | |
| HRP标记的山羊抗兔IgG（ZB-2301） | ZSGB-BIO | ZB-2301 | |
| HRP标记的山羊抗小鼠IgG（ZB-2305） | ZSGB-BIO | ZB-2305 | |
| 动物实验 | D-荧光素钾盐 | meilunbio | -- |
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Hyclone | -- |
| RPMI 1640培养基 | Hyclone | -- | |
| 胎牛血清 | Bioind | -- | |
| 青霉素 | Thermo Scientific | -- | |
| 链霉素 | Thermo Scientific | -- | |
| 流式细胞分析 | IV型胶原酶 | Roche | -- |
| 脱氧核糖核酸酶I | Roche | -- | |
| 可固定活性染色450（562247） | BD Biosciences | 562247 | |
| LSR Fortessa流式细胞仪 | BD Biosciences | -- | |
| 实时定量PCR | 动物总RNA提取试剂盒 | Foregene Co., Ltd | -- |
| HiScript II Q RT SuperMix用于qPCR（+gDNA Wiper） | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| AceQ SYBR qPCR预混液 | Vazyme Biotech Co., Ltd. | -- | |
| 免疫印迹 | RIPA裂解液 | Beyotime | -- |
| 蛋白酶抑制剂混合物 | MCE | -- | |
| 磷酸酶抑制剂混合物I | MCE | HY-K0021 | |
| BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Scientific | -- | |
| PVDF膜（IPVH00010） | Millipore | IPVH00010 | |
| FUSION FX. EDGE成像系统 | VILBER LOURMAT | -- | |
| 细胞因子检测 | QuantiCyto小鼠IFN-γ ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- |
| QuantiCyto小鼠TNF-α ELISA试剂盒 | NeoBioscience | -- | |
| 免疫荧光 | 共聚焦荧光显微镜（ZEISS, LSM 880, DE） | ZEISS | LSM 880 |
| 动物实验 | IVIS Lumina III成像系统 | PerkinElmer | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基种类（DMEM或RPMI 1640）、血清浓度、抗生素浓度 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Mice and Cell Lines' 部分 |
| 皮下移植瘤模型 | 细胞接种量（MC38 1×10^6，CT26 5×10^5）、接种部位、肿瘤体积测量间隔、分组标准、福替尼给药剂量和途径、αPD-1给药方案 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Animal Experiments' 部分及 Figures 1, 2, 5 图注 |
| 肺转移模型 | CT26-Luc细胞接种量（2×10^5）、注射途径、给药开始时间、生物发光成像时间 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Animal Experiments' 部分及 Figure 6 图注 |
| CD8+ T细胞清除实验 | αCD8抗体克隆、剂量（250 μg/只）、注射时间点 阅读提示：Materials and Methods 中的 'CD8+ T Cell Depletion' 部分 |
| 流式细胞术 | 组织消化条件（胶原酶IV和DNase I浓度、消化时间）、抗体克隆和荧光标记、死活鉴别染色、数据采集和分析软件 阅读提示：Materials and Methods 中的 'FCM Analysis' 部分 |
| 免疫印迹 | 细胞处理浓度和时间、组织裂解方法、抗体稀释比例、内参抗体 阅读提示：Materials and Methods 中的 'Western-Blot' 部分 |