蛋白质组与磷酸化蛋白质组定量比较
鉴定与淋巴结转移相关的差异表达蛋白质和磷酸化位点
使用TMT标记定量质谱分析23例GAC患者的45个冷冻组织样本（22对肿瘤与癌旁组织加1个额外肿瘤样本），比较有LNM（n=12）和无LNM（n=11）患者的肿瘤组织。
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胃腺癌的整合蛋白质组和磷酸化蛋白质组分析揭示能够对患者预后进行分层的分子特征
Integrated proteome and phosphoproteome analysis of gastric adenocarcinoma reveals molecular signatures capable of stratifying patient outcome.
实验完整度
高包含蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、转录组学分析、Western blot、免疫组化验证及细胞功能实验（划痕、Transwell、CCK-8）等多个独立证据层级。
主要模型
胃腺癌患者原发肿瘤组织（伴或不伴淋巴结转移） 胃癌细胞系HGC27、MGC803、BGC-823、SGC-7901
重点核对
LNM与非LNM患者的肿瘤组织比较，样本量为LNM组12例、非LNM组11例 TNXB抗体处理胃癌细胞使用的浓度为0.1%，处理时间为24小时 Wound-healing实验中HGC27的重复数n=11，MGC803的重复数对照n=11、抗体组n=7 Trans-well实验使用的细胞数为4×10^5，迁移时间为24小时 细胞活性实验使用的细胞数为2×10^3，CCK-8测量时间为2小时
摘要
转移是胃癌患者生存率低的主要原因之一。探索胃腺癌（GAC）进展中的关键蛋白可能为预后生物标志物开发和治疗干预提供新的候选分子。我们应用定量质谱技术比较了有淋巴结转移（LNM）和无淋巴结转移GAC患者的原发肿瘤组织的蛋白质组和磷酸化蛋白质组。随后，我们对蛋白质组和转录组数据进行了整合分析以揭示分子特征。我们共定量了5536种蛋白质，与无LNM患者相比，有LNM患者的肿瘤样本中发现218种蛋白质上调和49种蛋白质下调。聚类分析鉴定出一组中枢蛋白，这些蛋白先前已被证明在胃癌进展中发挥重要作用。我们还发现两种胞外蛋白TNXB和SPON1在LNM患者中过表达，这与GAC患者的较差生存相关。TNXB和SPON1的过表达通过western blotting和免疫组化得到验证。此外，用抗TNXB抗体处理胃癌细胞显著降低了细胞迁移。最后，定量磷酸化蛋白质组分析与基于活性的激酶捕获相结合，揭示了LNM患者原发肿瘤组织中若干激活的激酶，其中GSK3可能是值得进一步研究的新靶点。我们的研究提供了具有转移潜能的GAC肿瘤组织的蛋白质组和磷酸化蛋白质组概览，并确定了GAC进展的潜在生物标志物。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 胃腺癌患者原发肿瘤组织中哪些蛋白质和磷酸化位点与淋巴结转移相关，且可作为预后标志物或治疗靶点？
- 核心机制
- TNXB可能通过与ITGB1相互作用促进胃癌细胞迁移；GSK3（GSK3A和GSK3B）的异常激活可能参与淋巴结转移。
- 主要证据
- 定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析发现TNXB和SPON1过表达，Western blot和免疫组化验证；功能实验表明抗TNXB抗体减少细胞迁移；ABPP实验显示GSK3A的ATP结合能力增强。
- 研究意义
- 研究提供了GAC进展的潜在预后生物标志物和潜在治疗靶点，有助于识别具有转移高风险的GAC患者，指导更积极的治疗。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
生物信息学分析与候选生物标志物筛选
识别与GAC进展和预后相关的关键蛋白和通路
对差异表达蛋白进行GO/KEGG富集、蛋白质相互作用网络构建、Mfuzz聚类及TCGA转录组数据分析，锁定TNXB和SPON1。
候选标志物表达验证
验证TNXB和SPON1在蛋白水平的表达差异
通过Western blot和免疫组化检测有LNM和无LNM的GAC肿瘤组织中TNXB和SPON1的表达。
TNXB功能研究
探究TNXB对胃癌细胞迁移和增殖的影响
在HGC27和MGC803细胞中使用抗TNXB抗体处理，进行划痕实验、Trans-well迁移实验和CCK-8细胞活性实验。
激酶活性分析
鉴定与淋巴结转移相关的异常激活激酶
利用KSEA预测激酶活性，并应用ABPP实验捕获ATP结合激酶，验证GSK3A和GSK3B的异常激活。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证样本或模型特征
验证细胞功能变化
验证免疫效应
验证机制链路
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 蛋白质组学样本制备 | 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物 | Thermo Scientific | 78440 |
| 组织匀浆机 | Jingxin | JXFSTPRP-24/32 | |
| 蛋白质定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 23225 |
| 蛋白质消化 | 三乙基碳酸氢铵 | Sigma-Aldrich | 140023 |
| 蛋白质标记 | TMT 10-plex标记试剂 | Thermo Scientific | 90110 |
| 离线分离 | 碱性反相分离试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 84868 |
| 磷酸化肽富集 | 二氧化钛微珠 | GL Sciences | 5020-75000 |
| 激酶活性分析 | KiNative试剂盒 | Thermo Fisher Scientific | 88310 |
| Western blot | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 抗TNXB抗体 | Proteintech | 13595-1-AP | |
| 抗SPON1抗体 | Bioss | Bs-7520R | |
| 抗ACTB/β-肌动蛋白抗体 | Yeasen | 30101-ES10 | |
| 抗小鼠IgG二抗 | Yeasen | 33219ES60 | |
| 抗兔IgG二抗 | Yeasen | 33119ES60 | |
| 细胞迁移实验（划痕和Trans-well） | RPMI 1640培养基 | -- | -- |
| Trans-well迁移实验 | Trans-well小室 | Corning | 3422 |
| 细胞活性实验 | CCK-8试剂 | Yeasen | 40203ES76 |
| 免疫组化 | 免疫组化试剂盒（DAB，兔） | NeoBioscience | ENS004 |
| 抗TNXB抗体 | Proteintech | 13595-1-AP | |
| 抗SPON1抗体 | Origene | TA351750 | |
| 蛋白质组学数据搜索 | MaxQuant | -- | -- |
| 统计分析 | R | -- | -- |
| GraphPad Prism 8.0 | GraphPad Software Inc. | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 蛋白质组学分析 | 样本量：肿瘤组织23例，癌旁组织22例；分组：有LNM（n=12）无LNM（n=11）；TMT标记批次内内标校准；差异表达蛋白筛选阈值：倍数变化≥1.5或≤0.67，P<0.05 阅读提示：Materials and methods 2.2和2.5，Results 3.1 |
| 磷酸化蛋白质组学分析 | 磷酸化肽富集条件：TiO2富集；差异磷酸化位点筛选阈值：倍数变化≥1.5或≤0.67，P<0.05；磷酸化位点定量归一化处理 阅读提示：Materials and methods 2.3和2.5，Results 3.6 |
| Western blot验证 | 抗体信息：TNXB 1:500（Proteintech），SPON1 1:200（Bioss），ACTB 1:5000（Yeasen）；样本量：肿瘤组织n=5，细胞n=3 阅读提示：Materials and methods 2.12，Results 3.3 |
| 细胞功能实验 | 细胞系：HGC27、MGC803；抗体浓度：0.1%抗TNXB抗体；划痕实验时间：24小时；Trans-well实验细胞数：4×10^5，时间：24小时；CCK-8细胞数：2×10^3，测量时间：2小时 阅读提示：Materials and methods 2.13-2.15，Results 3.4 |
| 激酶活性分析 | ABPP实验样本：有LNM和无LNM各4例；ABPP探针浓度：20mM；蛋白质用量：2mg；KSEA参数：NetworKIN cutoff 2.5，P<0.05，substrate count≥5 阅读提示：Materials and methods 2.4和2.11，Results 3.7 |