体外病毒特性验证
验证Ad-IL15能否感染肿瘤细胞并表达IL-15，同时评估其溶瘤能力和安全性。
用Ad-IL15感染人肿瘤细胞系（A549, U87, MDA-MB-231）和小鼠肿瘤细胞系（LLC, MC38, B16-F10），检测IL-15分泌、细胞活力（CCK-8）和病毒蛋白表达。
关于丁香通
公司信息
个人用户
企业机构
无忧采购 轻松科研
- 移动端
溶瘤腺病毒通过STING介导的DC激活促进血管正常化和非经典三级淋巴结构形成
Oncolytic adenovirus promotes vascular normalization and nonclassical tertiary lymphoid structure formation through STING-mediated DC activation.
实验完整度
高包含体外细胞实验、两种小鼠肿瘤模型、RNA-seq、流式细胞术、免疫荧光和体内验证，并利用抑制剂验证机制。
主要模型
B16-F10黑色素瘤小鼠模型 MC-38结肠癌小鼠模型 骨髓来源树突状细胞（BMDC）
重点核对
病毒注射剂量：5×10^8 PFU，每次40 µL，隔日注射，共3次 肿瘤体积监测：使用公式L×W^2×0.5计算，达到约50 mm^3时开始治疗 免疫细胞分析：流式细胞术检测CD45+、CD8+、CD4+、NK、NKT、TRM等细胞比例 血管正常化指标：PDGFRβ+周细胞覆盖、lectin+功能性血管、VCAM-1+血管 TLS形成：免疫荧光检测CD45、PNAd、CD3、B220、CD11c、CD31等
摘要
在肿瘤微环境（TME）中诱导完整的抗肿瘤免疫反应对于成功的癌症免疫治疗至关重要。在此，我们报道了一种携带mIL-15的溶瘤腺病毒（Ad-IL15）能够在癌症小鼠模型中有效诱导抗肿瘤免疫反应并抑制肿瘤生长。我们发现Ad-IL15促进了TME中包括树突状细胞（DCs）、T细胞和自然杀伤（NK）细胞在内的免疫细胞的活化和浸润。出乎意料的是，我们观察到Ad-IL15还诱导了TME中的血管正常化和三级淋巴结构形成。此外，我们证明了Ad-IL15诱导的TME变化依赖于Ad-IL15诱导的DCs中STING-TBK1-IRF3通路的激活。总之，我们的发现表明Ad-IL15是癌症免疫治疗的候选药物，可促进免疫细胞活化和浸润、肿瘤血管正常化以及TME中三级淋巴结构的形成。
实验结论
提炼研究问题、关键发现与证据，快速把握文章的核心贡献。
- 研究问题
- 溶瘤腺病毒Ad-IL15是否能在肿瘤微环境中诱导抗肿瘤免疫反应，并通过何种机制促进血管正常化和三级淋巴结构形成。
- 核心机制
- Ad-IL15通过激活DCs中的STING-TBK1-IRF3通路，促进DC成熟，进而增强免疫细胞浸润、血管正常化和非经典TLS形成。
- 主要证据
- RNA-seq和流式细胞术显示Ad-IL15激活DC并上调血管正常化和TLS相关基因；体内实验中Ad-IL15治疗增加TIL浸润、促进血管成熟和TLS形成，而TBK1抑制剂Amlexanox可阻断这些效应。
- 研究意义
- 该研究为OV治疗机制提供见解，并表明靶向TME是进一步研究抗肿瘤OV的潜在策略。
研究路径
按研究推进顺序梳理实验设计、验证步骤与关键观察。
体内抗肿瘤效果评估
评估Ad-IL15在免疫活性小鼠模型中的抗肿瘤作用和对肿瘤浸润淋巴细胞的影响。
建立B16-F10和MC-38皮下肿瘤模型，瘤内注射PBS、Ad或Ad-IL15，监测肿瘤体积，并通过流式细胞术分析肿瘤浸润免疫细胞。
血管正常化和TLS形成评估
检测Ad-IL15治疗对肿瘤血管结构、功能和三级淋巴结构形成的影响。
收集肿瘤组织，通过免疫荧光和RT-PCR分析缺氧、血管成熟标志物、淋巴管密度以及TLS相关细胞和结构。
机制验证
验证Ad-IL15是否通过STING通路激活DC，从而介导血管正常化和TLS形成。
分离BMDC并刺激，进行RNA-seq分析差异表达基因，然后用TBK1抑制剂Amlexanox验证STING通路参与。
体内机制验证
验证STING通路在Ad-IL15诱导的免疫激活、血管正常化和TLS形成中的体内作用。
在B16-F10模型中，用Amlexanox与Ad/Ad-IL15联合治疗，分析肿瘤生长、免疫细胞浸润、血管标志物和TLS形成。
研究方法
按研究目的归类文中使用的方法，便于定位所需技术。
验证免疫细胞浸润和功能
验证血管和TLS结构
产品清单
| 实验环节 | 名称 | 品牌 | 货号 |
|---|---|---|---|
| 细胞培养 | DMEM培养基 | Gibco | -- |
| RPMI-1640培养基 | Gibco | -- | |
| 胎牛血清 | -- | -- | |
| 病毒构建 | DH5α感受态细胞 | -- | -- |
| 细胞活力检测 | 细胞计数试剂盒-8 | Meitune | -- |
| 细胞因子检测 | 小鼠IL-15 ELISA试剂盒 | Neobioscience | -- |
| 蛋白提取 | RIPA裂解液 | -- | -- |
| 蛋白定量 | BCA蛋白定量试剂盒 | Beyotime | -- |
| Western blot | PVDF膜 | -- | -- |
| 增强化学发光底物 | -- | -- | |
| 抗原修复 | EDTA抗原修复缓冲液 | -- | -- |
| 免疫荧光 | DAPI染色液 | -- | -- |
| 血管灌注 | Alexa Fluor 488标记的番茄凝集素 | Vector Laboratories | -- |
| 组织消化 | 胶原酶I | Gibco | -- |
| 胶原酶IV | Gibco | -- | |
| 流式染色 | 细胞染色缓冲液 | BioLegend | -- |
| 细胞内因子检测 | 固定/破膜液 | BD Biosciences | -- |
| 透化/洗涤缓冲液 | BD Biosciences | -- | |
| 细胞因子刺激 | PMA/离子霉素混合物 | -- | -- |
| 布雷非德菌素A/莫能菌素混合物 | -- | -- | |
| 细胞凋亡检测 | 7-AAD染色液 | -- | -- |
| RNA提取 | RNA快速纯化试剂盒 | Esunbio | -- |
| 逆转录 | PrimeScript RT预混液 | Takara | -- |
| qPCR | TB Green预混Ex Taq | Takara | -- |
| RNA-seq | TRIzol试剂 | -- | -- |
| Bgiseq500测序平台 | BGI | -- | |
| DC培养 | 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 | Peprotech | -- |
| 重组小鼠白细胞介素-4 | Peprotech | -- | |
| 机制验证 | 阿米洛诺克斯 | MedChemExpress | -- |
关键环节
汇总复现实验时建议重点确认的条件及原文阅读提示。
| 环节 | 核对要点 |
|---|---|
| 病毒构建 | 病毒构建步骤、质粒载体、包装细胞、病毒滴度检测方法 阅读提示：Materials and Methods - Viruses, Figure S1 |
| 细胞培养 | 细胞系来源、培养基、血清浓度、抗生素浓度、培养条件、传代次数 阅读提示：Materials and Methods - Cell lines |
| 动物模型 | 小鼠品系、周龄、性别、饲养条件、肿瘤细胞注射数量和部位、治疗剂量、时间和给药方式 阅读提示：Materials and Methods - Animal experiments, Figure 3 legend |
| 病毒处理与IL-15检测 | MOI值、感染时间、IL-15检测方法（ELISA）、标准曲线 阅读提示：Materials and Methods - In vitro infection experiments and mIL-15 measured |
| BMDC培养和刺激 | 骨髓细胞分离方法、GM-CSF和IL-4浓度、培养时间、刺激条件和时间 阅读提示：Materials and Methods - Bone marrow harvest and DC culture |
| Western blot | 抗体清单、稀释比例、阻断条件、孵育时间、显色方法 阅读提示：Materials and Methods - Western blotting, Table S1 |
| 免疫荧光 | 组织固定、切片厚度、抗原修复方法、抗体浓度、孵育时间、图像采集和分析软件 阅读提示：Materials and Methods - Immunofluorescence staining of mouse samples |
| 流式细胞术 | 组织消化酶浓度和时间、细胞过滤、抗体组合、染色步骤、固定破膜方案、数据分析软件 阅读提示：Materials and Methods - Multicolor flow cytometry |
| RNA提取和qPCR | RNA提取试剂盒、逆转录引物、qPCR条件、内参基因、引物序列 阅读提示：Materials and Methods - Quantitative real-time PCR (qPCR) |
| RNA-seq | RNA质检标准、文库构建方法、测序平台、数据分析流程和参数 阅读提示：Materials and Methods - RNA-seq and analysis |
| 生信分析 | 数据库来源、算法版本、统计检验方法和阈值 阅读提示：Materials and Methods - Bioinformatic analysis |
| 统计分析 | 统计软件版本、检验方法选择依据、显著性阈值、样本量 阅读提示：Materials and Methods - Statistical analysis |